免疫印迹（Western blot）检测

实验方法
1) 细胞收集与裂解。
胰酶消化法收集细胞，加入 2×Laemmli Buffer ，混匀，100℃，加热 5 min，转入冰水混合物中冷却。4℃，12,000 rpm，离心 5 min，上清转入新的 EP 管中，用 于蛋白浓度测定。
2) 蛋白浓度测定。
按照 BCA 法蛋白浓度测定试剂盒说明书测定细胞裂解液中的蛋白浓度， 简要流程如下：将试剂盒中的 A 液与 B 液按照 50:1 的比例混合，配制工作液。利用无菌 ddH2O 稀释蛋白标准品到 0.5 mg/ml，再利用 ddH2O 倍比稀释标准品，将稀释后的标准品 和样品中加入 96 孔板中，再加入配好的工作液 200 μl/孔，37 ℃孵育 30 min，酶标仪 562 nm 光波检测吸光度值，绘制标准曲线，并利用回归方程计算样品中的蛋白浓度。
3) 电泳与转膜。
利用聚丙烯酰胺凝胶配制套装，根据目的抗体分子量配制相应浓度的 SDSPAGE Gel。根据样品中的蛋白浓度，计算 30 μg 蛋白需要的样品体积，加入聚丙烯酰胺凝 胶孔中，转入电泳槽，进行电泳，80 v 恒压电泳至样品中的指示剂（溴酚蓝）进入分离胶， 120 v 恒压电泳至指示剂达到胶底部。停止电泳，剥离聚丙烯酰胺凝胶，切除浓缩胶，保 留分离胶，置于 PVDF 膜上，并夹上滤纸和海绵，制备三明治结构，插入电转槽，加入电 转液，200 mA 恒流电转 2 h，取出 PVDF 膜，TBST 洗膜 3 次×5min 后置于 5%脱脂奶粉 （TBST 配制）中，室温，封闭 1 h。
4) 抗体孵育
a) 一抗孵育。从封闭液中取出 PVDF 膜，TBST 洗涤 3 次×5 min，转入配置好的一抗溶 液中，4 ℃水平摇床上旋转摇晃，孵育过夜（12-14 h）。
b) 二抗孵育。用 TBST 洗涤膜 3 次×5 min，转入配制好的二抗溶液中。二抗用含 5%脱 脂奶粉（TBST 配制）稀释。室温孵育 60 min。
5) 显影并拍照
a) 洗涤。二抗孵育完毕，利用 TBST 洗涤 PVDF 膜，3 次×5 min。
b) 提起 PVDF 膜，沥干膜上过多洗涤液。
c) 将膜平铺在显影板上，滴加配好的 ECL 反应液，放入化学发光成像仪。
d) 拍照。
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