“剪”得断，理不乱| CRISPR/Cas9技术简史（上）

    基因组编辑（Genome Editing）又称基因编辑，是基因工程的一种，指在活体基因组中进行DNA插入、删除、修改或替换的一项技术。其中，CRISPR/Cas9技术是目前基因编辑领域内应用最广的技术，该项技术一经诞生就被人们视为21世纪最为重要的生物发现之一。它稳定高效，已经被全球各地的研究人员应用在各种生物的基因修复、基因改造等技术中。

    然而，这一技术从被发现到被广泛应用还不到10年时间。

什么是CRISPR/Cas？

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 规律间隔成簇短回文重复序列)，是存在于细菌和古菌基因组内的⼀段重复序列。

Cas (CRISPR-associated, CRISPR关联）蛋⽩，由总是出现在CRISPR区域附近的CRISPR关联基因编码的蛋白。Cas9是其中一种核酸内切酶，即能从核酸的内部切开双链的酶。

    在自然界中，CRISPR/Cas系统能为细菌和古⽣菌提供对病毒和质粒的适应性免疫。现在，科学家通过对这个系统的重新设计和编程，可以精确识别并切断目标DNA，并诱导细胞进行DNA修复，最终实现基因敲除和基因修改。

细菌的CRISPR。钻石是“重复序列”，正方形是重复序列之间的“间隔成簇”，钻石与正方形有“规律”地在染色体内密集出现，而不是随机分布。
（图片来自《破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量》）

“发现”的历程

——  1993，西班牙科学家Francisco Mojica在其他细菌和古菌中发现相似的重复序列，并将其命名为SRSR (Short Regularly Spaced Repeats, 短间隔重复序列)。
——  2002年，Ruud Jansen及他的同事首次在印刷品中使用CRISPR一词。他们还发现这些序列一般可以在CRISPR相关基因，即Cas基因旁边找到，而Cas基因所编码的蛋白质结构与那些能与DNA发生相互作用的酶的结构很相似。因此，他们推测Cas基因与CRISPR序列存在“功能上的关系”，但这种关系的作用还不清楚。

• 病毒DNA⽚段夹在细菌的重复结构中，就像是细菌在基因组⾥收藏了病毒不同⾓度的快照。凭什么仅靠记录⼀张病毒的快照，细菌就能够防御未来的病毒入侵呢？
• 现在我们知道，细菌在遭到病毒⼊侵后，能够把病毒基因的⼀⼩段存储到⾃⾝DNA中的CRISPR序列。当再次遇到病毒⼊侵时，细菌能够根据存写的⽚段识别病毒，将病毒的DNA切断⽽使之失效。

——  从1993年到2005年间，Mojica发现，夹在重复序列之间的间隔序列与许多噬菌体（专门⼊侵细菌的病毒）的基因组序列信息⾼度⼀致，提出了CRISPR是细菌的⼀种适应性免疫机制的假设。
——  2007年，在丹麦丹尼斯克公司（Danisco，世界知名的食品添加剂生产商）⼯作的科学家Rodolphe Barrangou及其团队证明，在嗜热链球菌（⽣产酸奶必须的⼀种益生菌）中⼈⼯添加⼀段CRISPR序列，可以帮助细菌抵挡某种对应病毒的⼊侵。这是首次通过实验证明CRISPR的功能与抵抗噬菌体感染有关。他们还发现，对于嗜热链球菌而言，Cas基因控制了间隔序列的获取与整合，而间隔序列可以特异性地靶向识别再次侵染的噬菌体基因组，因此，他们猜想Cas基因在CRISPR实现的免疫过程中起着重要作用，但其中细节尚不清楚。2008年，荷兰科学家John van der Oost的团队通过在大肠杆菌中的实验证实，小RNA分子协助了细菌抗病毒反应中的识别和摧毁过程，他们称之为CRISPR RNA (crRNA)。同时，他们还通过人为设计相应的crRNA序列使细菌获得了抵抗噬菌体的特性，这是人类首次编辑CRISPR系统。

• CRISPR的RNA分子如何在细胞内产生，并从长链RNA转化成更短的、只包含单一病毒配对RNA的片段？
• 细菌细胞把整个CRISPR序列翻译成一条长RNA链，一种酶把它切成更短的RNA链，它们长度一致，但间隔序列不同。这个过程把DNA中较长的重复序列变成了更短的RNA分子文库，每一个RNA分子都包含一段特定的噬菌体序列。

• 什么是PAM，PAM在CRISPR/Cas系统中起到什么作用？
• PAM（Protospacer Adjacent Motif）是入侵病毒的一部分，但不在细菌CRISPR中出现。如果目标DNA序列后面没有PAM序列，Cas9将不能对目标DNA进行干扰。PAM对靶向识别起着重要作用，它能帮助区分细菌自身和非自身DNA，从而防止细菌本身被CRISPR相关核酸酶锁定和破坏。

——  2011年3月，瑞典于默奥⼤学的法国科学家Emmanuelle Charpentier领导的实验室在发现，除了crRNA外，还存在第⼆个RNA分子，他们称之为trans-activating crRNA (tracrRNA)。在化脓链球菌中，tracrRNA对于病毒的失活是必需的。tracrRNA与crRNA形成双链体，将Cas9蛋白（当时被称为Csn1蛋白）引导⾄其靶标。
——  2011年8月，立陶宛维尔纽斯大学的科学家Virginijus Siksnys和丹麦丹尼斯克公司的科学家，在大肠杆菌中重组了嗜热链球菌的CRISPR系统，这种重建的CRISPR系统仍然可以实现对噬菌体DNA的靶向干扰。此外，他们还证明了，对于嗜热链球菌对应的CRISPR/Cas系统而言，Cas9核酸酶是是实现干扰所需要的唯/一蛋白质，这是II类CRISPR系统的显着特征（I类CRISPR/Cas系统中，RNA与多个Cas蛋白结合，形成识别和切割DNA的分子复合体；II类CRISPR/Cas系统则是由单个效应Cas蛋白来发挥功能）。

至此，细菌CRISPR/Cas9系统切割噬菌体DNA的三个核心要件：Cas9、crRNA和tracrRNA皆被发现。

（图片来自《破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量》）

——  2012年6⽉28日，美国加州⼤学伯克利分校的科学家Jennifer Doudna和瑞典于默奥⼤学的科学家Emmanuelle Charpentier领衔的研究团队合作在Science杂志发表论⽂（2012年6月8日投稿），他们通过体外试验证明，crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成特殊的双链RNA结构，指导Cas9在靶标DNA上引起双链断裂。团队还将系统所需的两条RNA融合改造成⼀条更加易⽤的单链向导RNA (single-guide RNA, sgRNA)，并证明了⼈⼯设计的向导RNA同样可以指导Cas9蛋⽩切割任意指定的⼀段DNA序列。

2020年10月，这两位科学家被授予2020年诺贝尔化学奖，以表彰她们对“基因剪刀”CRISPR/Cas9的贡献。
（图片来自 nobelprize.org）

 

参考文献

1.王立铭. 上帝的手术刀——基因编辑简史[M]. 浙江: 浙江人民出版社, 2017.

2.[美] 詹尼佛·A.杜德娜、[美]塞缪尔·H·斯坦伯格. 破天机——基因编辑及其控制演化的惊人力量[M]. 湖南: 湖南科学技术出版社, 2020.

国内领先的生命科学领域耗材制造商
无锡耐思生命科技股份有限公司（以下简称“耐思”）于 2009 年成立，并创立 NEST 品牌，秉持“做高端耗材，创国际知名品牌”的信念，专注于生命科学领域产品的研发与制造。耐思拥有 7500m² 十万级洁净车间，2500m² 万级洁净车间，成熟的生产工艺、先进的机器设备、专业的研发中心、资深的管理团队，是国内领先的医疗器械和生命科学领域耗材制造商。
2020 年，公司正式更名为无锡耐思生命科技股份有限公司。
 
美国分公司成立
随着业务的发展，NEST 产品已远销北美、欧洲、日本、韩国、印度等全球多个国家，为了与海外客户建立深厚的合作关系，并更快地将产品送到海外客户手中， 我们于2003年在美国新泽西州成了了NEST美国分公司。NEST美国是属于无锡耐思生命科技股份有限公司的分支机构，拥有一支具有丰富经验和销售技巧的专业团队，能与客户进行深入的沟通，更好更快地了解客户需求，并给予专业的技术支持。2022年，NEST美国将在亚利桑那州凤凰城开设一个新的48,000英尺的仓库，随着新仓库的落成，将为客户极大的降低了存储与物流成本。
 
引进先进设备，确保品质稳定
耐思为确保质量的稳定，实现“原料采购 - 生产 - 包装 - 灭菌 - 交付”的无缝对接， 2012年投资1.5亿新建了2.7万平米厂房（无尘洁净车间），且引进国际先进电子辐照设备RhodotronTT200（辐照灭菌流程经 ISO13485、ISO11137 质量体系认证），进口符合USP CLASS 6的医用级原材料，按GMP质量管理规范标准化生产，现已取得ISO 9001、ISO 13485、ISO 11137、FDA、CE 认证及医疗器械生产许可证。
2021年NEST新增4500m²十万级洁净车间和1500m²万级洁净车间，用于医疗器械与医药包装耗材的生产。
 
三大类产品——实验室耗材、医疗器械、医药包装耗材
耐思的产品分为三大类：实验室耗材（细胞学类耗材、微生物检测类耗材、分子生物学类耗材、通用耗材类）、医疗器械和医药包装耗材。产品适用于医药、农业、轻化工、食品、环保、生物能源、海洋生物资源、再生医学等生命科学领域，品项多、规格全，满足了客户不同的需求。相比进口耗材，NEST 货期短、品质优、价格低，可大大提高工作效率并降低使用成本。
 
定制服务
无锡耐思生命科技股份有限公司拥有强大的模具设计能力及机床精密加工及塑料成型能力，除常规品的销售，同时向行业提供各种定制服务。
 
发展历程
2009年，成立：创立NEST品牌，从细胞培养类产品开始研发
2010年，市场开拓：参加德国慕尼黑，美国PITTCON，正式开始进军海外市场
2011年，通过ISO 9001认证
2012年，筹建新工厂
2013年，美国耐思成立：新增分子生物学耗材，开始研发细胞工厂
2014年，新车间投入生产，灭菌中心通过ISO 11137认证：投资1.5亿新建2.7万平米厂方，引进比利时RhodotronTT200电子束辐照设备灭菌中心通过ISO11137认证
2015年，灭菌中心正式投入使用
2016年，通过ISO 13485认证：细胞工厂验证完成，正式投放市场
2017年，完善工业类客户产品线：细胞工厂系列、摇瓶系列等产品上市
2018年，优化管理，升级设备，研发医疗器械类产品，为获取医疗器械生产许可证而做准备
2019年，取得医疗器械生产许可证，销量破亿
2020年，无锡耐思生命科技股份有限公司成立，开发新冠防疫物资
2021年，在美国新泽西州新增3300m²仓库和研发基地
2022年，在美国亚利桑那州新增4500m²的仓库，极大的降低了存储与物流成本
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