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大鼠原代软骨细胞的应用与操作方法！
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大鼠原代软骨细胞的应用与操作方法！
一、背景
大鼠原代软骨细胞存在于关节软骨中，负责分泌II型胶原和其它类型的胶原以及非胶原的细胞外基质大分子。成软骨细胞的增殖和分化与脊椎动物骨架的发育有着密切的关系。软骨细胞能分泌和响应一系列的生长因子，包括IGF-1和IL1。体外培养的软骨细胞是研究软骨修复和关节炎病理的有用模型。
二、胞复苏操作要点
1、将基在37℃水浴锅预热；一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热基。
2、将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，避免引起污染。
3、用75%酒精冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至好的离心管内，轻轻吹打，使细胞均匀分散，DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4、800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的基，吹打制成细胞悬液。
5、将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内。
6、第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜基以去除死细胞。继续，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
三、细胞特性
1、组织来源于实验动物的关节组织。
2、细胞鉴定：Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)免疫荧光染色为阳性。
3、经鉴定细胞纯度高于90%。
4、不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5、细胞生长方式：长梭状，不规则细胞，贴壁培养。
四、贴壁细胞传代
1、提前将基、PBS放入37℃水浴锅内预热，用75%酒精后再放入超净台内。
2、吸除或倒掉细胞瓶内旧液，加少量PBS润洗细胞。
3、加入适量胰酶，使胰酶的量能盖住细胞，37℃孵育，每隔2~3min显微镜下观察，待贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时弃去胰酶，加入新鲜基，晃动细胞瓶，终止胰酶作用。原代细胞大鼠软骨细胞采购商
4、用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液。控制吹打的力度，避免产生大量的气泡。
5、将细胞悬液分别接种到另外的2~3个细胞瓶内，加入新鲜基，置37℃温箱，隔天观察贴壁生长情况。
五、应用
大鼠原代软骨细胞可用于促甲状腺激素对小鼠原代软骨细胞增殖和分化的影响：
甲状腺功能减退症(subclinicalhypothyroidism,SCH),简称亚甲减,是临床上常见的内分泌代谢性疾病。亚甲减患者虽然甲状腺激素水平在正常范围内,但是血清中促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平升高,偏离正常参考范围。已有研究证实,高TSH与甲状腺功能减退的小鼠骨骼发育异常有关,然而其细胞机制仍不清楚。
方法：1、小鼠原代软骨细胞(PMCs)的培养及处理:取小鼠膝关节,去除周围结缔组织,将软骨组织与深层软骨下骨仔细分离,缓冲液冲洗,剪碎软骨组织后用0.1%胶原酶消化18.5 h,离心去上清,依次经100μm和40μm滤网过滤。洗涤后用含10%胎牛血清(FBS)、1%双抗和100μM维生素C的培养液分散培养。隔天换液,待细胞融合度达到70%-80%时,换成含1%FBS的培养基分别以不同处理培养48h,尽可能减少血清中脂蛋白及各种激素对实验的干扰作用。
2、用10 mU/ml bTSH处理PMCs特定的时间,设置对照组。用CCK8和EdU试剂盒检测细胞增殖活性。
3、用JC-1检测细胞线粒体膜电位的改变来观察细胞凋亡情况。应用Western blot检测促凋亡因子Bax和Bcl-2的表达水平。
4、用Western blot和免疫荧光染色检测自噬相关标志物如LC3、Beclin-1和p62,Western blot mTOR、p-AMPK和AMPK,用透射电镜检测PMCs的自噬情况。
5、采用Alcian blue染色检测亚甲减小鼠和正常小鼠软骨蛋白聚糖的表达水平。通过免疫荧光染色检测collagen ll和collagen l的表达情况。
6、通过RT-PCR检测不同整合素亚基的表达情况。结果1.CCK-8细胞增值活性检测发现,细胞活性在高浓度TSH(10 mU/ml)刺激24h后下降明显,低浓度组(1 mU/ml)在TSH刺激72h后,细胞增殖活性也比对照组产生显著降低(P<0.05),并持续下降。
EdU细胞增殖检测结果也表明,10mU/mlTSH刺激48h显著降低PMCs增殖能力(P<0.01),对照组有增值活性的细胞百分比为TSH刺激组的6倍。2.流式结果显示,TSH刺激增加线粒体膜电位的去极化,细胞发生凋亡。通过Western blot实验进一步验证,TSH刺激使促凋亡因子BAX蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2表达水平降低(P<0.01),Bcl-2与BAX蛋白表达水平的比值降低(P<0.05)。3.TSH刺激降低软骨细胞自噬水平。Western blot检测结果表明,LC3 11(P<0.05)和Beclin-1(P<0.01)的表达水平降低,且在免疫荧光试验的结果中得到了验证。
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一、背景
大鼠原代软骨细胞存在于关节软骨中，负责分泌II型胶原和其它类型的胶原以及非胶原的细胞外基质大分子。成软骨细胞的增殖和分化与脊椎动物骨架的发育有着密切的关系。软骨细胞能分泌和响应一系列的生长因子，包括IGF-1和IL1。体外培养的软骨细胞是研究软骨修复和关节炎病理的有用模型。
二、胞复苏操作要点
1、将基在37℃水浴锅预热；一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热基。
2、将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过易受损的温度段（-5~0℃）。注意冻存管管口不能没入水中，避免引起污染。
3、用75%酒精冻存管后再置于超净台内，将管内细胞转移至好的离心管内，轻轻吹打，使细胞均匀分散，DMSO浓度，吹打时避免产生气泡。用新鲜基洗管壁2次，均转移至离心管内。
4、800rpm离心5min，弃上清，加入新鲜的基，吹打制成细胞悬液。
5、将细胞悬液转移至T25细胞瓶内，补加适量的基，轻轻晃动细胞瓶使细胞分布均匀，放入温箱内。
6、第二天观察细胞贴壁生长情况，换新鲜基以去除死细胞。继续，待细胞长至80~90%汇合时正常传代。一般刚复苏的细胞需经过2~3次传代，细胞活力恢复后才能进行后续的实验。
三、细胞特性
1、组织来源于实验动物的关节组织。
2、细胞鉴定：Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)免疫荧光染色为阳性。
3、经鉴定细胞纯度高于90%。
4、不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5、细胞生长方式：长梭状，不规则细胞，贴壁培养。
四、贴壁细胞传代
1、提前将基、PBS放入37℃水浴锅内预热，用75%酒精后再放入超净台内。
2、吸除或倒掉细胞瓶内旧液，加少量PBS润洗细胞。
3、加入适量胰酶，使胰酶的量能盖住细胞，37℃孵育，每隔2~3min显微镜下观察，待贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时弃去胰酶，加入新鲜基，晃动细胞瓶，终止胰酶作用。原代细胞大鼠软骨细胞采购商
4、用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液。控制吹打的力度，避免产生大量的气泡。
5、将细胞悬液分别接种到另外的2~3个细胞瓶内，加入新鲜基，置37℃温箱，隔天观察贴壁生长情况。
五、应用
大鼠原代软骨细胞可用于促甲状腺激素对小鼠原代软骨细胞增殖和分化的影响：
甲状腺功能减退症(subclinicalhypothyroidism,SCH),简称亚甲减,是临床上常见的内分泌代谢性疾病。亚甲减患者虽然甲状腺激素水平在正常范围内,但是血清中促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平升高,偏离正常参考范围。已有研究证实,高TSH与甲状腺功能减退的小鼠骨骼发育异常有关,然而其细胞机制仍不清楚。
方法：1、小鼠原代软骨细胞(PMCs)的培养及处理:取小鼠膝关节,去除周围结缔组织,将软骨组织与深层软骨下骨仔细分离,缓冲液冲洗,剪碎软骨组织后用0.1%胶原酶消化18.5 h,离心去上清,依次经100μm和40μm滤网过滤。洗涤后用含10%胎牛血清(FBS)、1%双抗和100μM维生素C的培养液分散培养。隔天换液,待细胞融合度达到70%-80%时,换成含1%FBS的培养基分别以不同处理培养48h,尽可能减少血清中脂蛋白及各种激素对实验的干扰作用。
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3、用JC-1检测细胞线粒体膜电位的改变来观察细胞凋亡情况。应用Western blot检测促凋亡因子Bax和Bcl-2的表达水平。
4、用Western blot和免疫荧光染色检测自噬相关标志物如LC3、Beclin-1和p62,Western blot mTOR、p-AMPK和AMPK,用透射电镜检测PMCs的自噬情况。
5、采用Alcian blue染色检测亚甲减小鼠和正常小鼠软骨蛋白聚糖的表达水平。通过免疫荧光染色检测collagen ll和collagen l的表达情况。
6、通过RT-PCR检测不同整合素亚基的表达情况。结果1.CCK-8细胞增值活性检测发现,细胞活性在高浓度TSH(10 mU/ml)刺激24h后下降明显,低浓度组(1 mU/ml)在TSH刺激72h后,细胞增殖活性也比对照组产生显著降低(P<0.05),并持续下降。
EdU细胞增殖检测结果也表明,10mU/mlTSH刺激48h显著降低PMCs增殖能力(P<0.01),对照组有增值活性的细胞百分比为TSH刺激组的6倍。2.流式结果显示,TSH刺激增加线粒体膜电位的去极化,细胞发生凋亡。通过Western blot实验进一步验证,TSH刺激使促凋亡因子BAX蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2表达水平降低(P<0.01),Bcl-2与BAX蛋白表达水平的比值降低(P<0.05)。3.TSH刺激降低软骨细胞自噬水平。Western blot检测结果表明,LC3 11(P<0.05)和Beclin-1(P<0.01)的表达水平降低,且在免疫荧光试验的结果中得到了验证。
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