平末端DNA加T试剂盒

特别提示：包括平末端DNA加T试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：平末端DNA加T试剂盒
英文名称：dT Tailing Kit
产品货号：BTN60106
产品规格：50次

本产品利用Taq DNA polymerase的不依赖于模板的末端转移酶活性，在只有dTTP存在的情况下，在平末端的DNA片段加上一个dT尾巴，主要用于制备T载体。其流程图如下：


产品特点：
1. 简单，2X Tailing Buffer中含有所需要的所有成分,不需要单独准备。
2.适用于任何平末端的DNA片段，包括Pfu DNA成本polymerase等酶合成的DNA片段。
3. 加T后的载体可以作为T载体使用。

产品组成：

成分	规格
Taq DNA olymerase(5U/μL)	50μl
2×dT Tailing Buffer	1.25ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：反应前纯化处理：
平末端DNA片段或平末端质粒DNA可以采取胶回收和酚/氯fǎng抽提法等常规方法纯化，最后溶解在水或TE中，终浓度以0.1μg/μL为宜。必须注意的是，用Vent，Deep Vent，Pfu，Pwo等具有3到5外切活性的DNA聚合酶扩增得到的DNA片段，必须经过彻底的去除残留的酶的处理过程(如酚/氯fǎng抽提或Proteinase K处理)，否则它们将在加T反应时，切除掉加上的T尾巴，干扰反应。
二：加T反应
在干净的0.5mL或1.5mL离心管中，分别加入下列成分：

回收的DNA片段	0.2-2μg
2×dT Tailing Buffer	25μL
Taq DNA polymerase(5U/μL)	1μL
补水到	50μL
72℃保温2小时

三：反应后处理
加T反应后，Taq DNA polymerase将与DNA末端紧密结合，所以必须酚/氯fǎng抽提去除。如果使用Proteinase K处理后再用酚/氯fǎng抽提效果会更好。得到的DNA溶于适量水和TE中后即可用于后续连接反应。

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名称：农杆菌LBA4404化学感受态细胞
货号：BTN140385
规格：10×100μL
 本产品为LBA4404农杆菌化学感受态细胞，其具有利福平和链霉素抗性，适用于玉米、烟草等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达103cfu/μg。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期一年。

自备试剂：质粒DNA、液氮等

使用方法：

转化前准备
1.冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3.将抗性平板在28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1.取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。
2.无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，每100μL感受态细胞加1ug质粒DNA，轻柔混匀。冰水浴中静置10分钟。
3.将离心管置于液氮中速冻5分钟(注：也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮)。
4.迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟，不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。
5.加入800μl无抗生素的2×YT或LB液体培养基，28-30℃振荡培养2~3小时。使菌体复苏，表达抗性。
6.5000rpm离心1分钟收菌，保留100μL左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含有相应抗生素的LB固体培养基平板上，待平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28-30℃培养48-72小时。

名称：N端YFP标签融合蛋白质粒(黄色荧光蛋白)
货号：YT478
规格：1μg
本质粒是哺乳动物细胞表达质粒，用于表达N端含YFP(Yellow Fluorescent Protein, 黄色荧光蛋白)标签的融合蛋白。该质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。在多克隆位点的前面有一个YFP的完整编码序列，因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达N端含有YFP标签的融合蛋白。利用YFP的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位，也可以利用YFP抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。YFP与GFP高度相似，可以尝试用GFP抗体检测YFP。该质粒为卡那霉素抗性。转染细胞后，可以使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

本质粒质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	1-602
T3 promoter and T3 primer binding site	620-639
YFP	677-1393
Multiple cloning site	1394-1483
T7 promoter and T7 primer binding site	1503-1524
SV40 polyA signal	1536-1919
f1 origin of ss-DNA replication	2057-2363
bla promoter	2388-2512
SV40 promoter	2532-2870
Neomycin/kanamycin resistance ORF	2905-3696
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal	3697-4155
pUC origin	4284-4951

本质粒(5003bp)的图谱如下：


使用说明：
1. 首次使用时请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2. 本质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因，构建的质粒可以用常规方法转染细胞。

储存条件：-20℃。

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货号	名称	规格
BTN81221	大肠杆菌HB101化学感受态细胞	0.1mL*10
BTN130559	大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)感受态细胞	0.1mL*10
BTN140384	农杆菌GV3101化学感受态细胞	10×100μL
BTN70602	DNA快速连接试剂盒	100次
BTN60210	硫酸链霉素溶液	10mL
YT445	AP1荧光素酶报告基因质粒	1μg

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