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用于宽场显微镜的高速荧光寿命成像
快速的细胞过程、移动的粒子和快速的图像采集历来是使用单光子计数技术进行寿命成像的挑战。宽场 FLIM 套件通过在宽场照明装置中实现视频速率寿命成像，解决了这些限制。该套装将Pi Imaging的高分辨率SPAD512² 相机与PicoQuant的多功能脉冲激光器组合以及通过NovaLITE软件进行的GPU 加速FLIM分析结合在一起。它专为兼容光片和其他宽场显微镜系统而设计，通过脉冲激发和时域门控检测引入了FLIM功能。NovaLITE简化了数据分析，针对 TIFF 文件格式进行了优化，确保了高效、准确的处理。
特点：
- 使用512x512像素时间门控SPAD相机进行宽场寿命成像
- 比共焦FLIM快达100倍
- 结合落射荧光和光片显微镜进行测试
- 激光选项适用于各种应用
- 易于使用的基于GPU的分析软件NovaLITE
应用：
FLIM宽场显微镜的应用
下面，我们将重点介绍我们的宽视场FLIM套装所擅长的两个关键应用： 光片FLIM和宽场FLIM。从二维宽场显微镜到使用光片技术对活体样本进行三维成像，每一种应用都展示了宽场FLIM套件在为高级生物研究提供高速、高精度成像方面的多功能性。
光片FLIM
在光片显微镜（或选择性平面照明显微镜，SPIM）中，样品的一个平面被光片照射，光片通常由圆柱透镜或来回扫描的光束产生。被照亮的平面随后通过相机成像。光片显微镜因其快速、柔和和三维功能，非常适合对大型活体样本进行研究。寿命成像提供的传感或同步多路复用与这些优势相辅相成，使光片 FLIM 成为一种非常有效的组合。
我们与法国艾克斯-马赛大学（Aix-Marseille Université）的研究人员合作，扩展了一种光片显微镜，以实现光片FLIM。该显微镜是一种专门的单物镜光片，针对有机体的高通量成像进行了优化。我们将该显微镜与用于脉冲照明的光纤耦合VisUV488和SPAD512²传感器（高速版本）相结合，在类器官样品上进行FLIM。
图中显示了光片 FLIM 如何用于同步多路复用。我们对小鼠胚胎干细胞生成的活体器官进行了成像。细胞核表达 H2B-GFP，细胞膜用 Flipper-TR 染色。
下面的视频显示的是有机体的三维成像，通过生命周期进行多路复用。对于该数据集，光片由来回扫描的高斯光束产生（488nm波长下的平均功率约为70µW），每个Z平面的采集时间为1.1s。刻度线为50µm。
有关其他结果，包括不同光片模式与共焦 FLIM 的比较以及活体有机体的三维张力图谱，请查阅 bioRxiv 上的预印本。
宽场 FLIM
在落射荧光宽场显微镜中，样品的一个区域被准直激光束照射。然后将激发的荧光成像到相机上。为了进行宽场荧光成像，我们扩展了一台落射荧光显微镜（Olympus IX73），配备了用于照明的光纤耦合高功率530nm激光器（LDH P-FA-530XL）和高速版 SPAD5122传感器。
图片显示的是商用固定细胞样本（Gattaquant，比例尺为5µm）的宽视场 FLIM 和共聚焦FLIM。线粒体和微管蛋白用光谱重叠的染料标记，但可通过寿命区分开来。即使在宽场 FLIM 上进行 40ms的采集，也能看到这种寿命对比。图中显示了随着成像速度的增加，寿命直方图的范围也在扩大。采集时间为300ms的宽场图像和采集时间为 5s的共聚焦图像的寿命直方图都是双峰的。不过，共焦图像中的生命周期分隔更大。这并不是门控采集的伪影，而是落射荧光显微镜缺乏切片的结果，在这种情况下，焦内和焦外的寿命是混合的。宽视场 FLIM 图像是在激光输出平均功率约为10mW 的情况下记录的，相当于视场中约50W/cm²。
宽场FLIM的高速性尤其有利于在对移动样品成像时避免运动模糊。视频显示了大型荧光珠在水中自由漂浮的实时画面（比例尺10µm）。溶液中含有两种不同类型的珠子，它们具有相似的光谱特性，但寿命不同。在视频中，以每秒23帧的帧频，可以根据荧光珠的寿命清楚地分辨出两种类型的荧光珠。
组件套件：
宽视场FLIM组件
照明选项
根据照明模式（如 Epi、TIRF、光片......）和样品的不同，宽场 FLIM 应用对照明光源的要求也大相径庭。在目前测试的应用中，所需的平均激光功率从数字扫描光片系统中的约 100 µW 到落射荧光宽场显微镜中的 25 mW 不等。我们将帮助您从 PicoQuant 大量的脉冲激光源组合中选择适合您应用的选项。
| 波长 | 脉冲宽度 | 平均功率(@20 MHz) | |
| VisUV-488 | 488 nm | < 60 ps | > 50 mW |
| VisUV-530 | 532 nm | < 85 ps | > 75 mW |
| LDH P-FA-530-XL | 532 nm | < 100 ps | > 50 mW |
| VisUV-560 | 561 nm | < 85 ps | > 35 mW |
标准光源：
高功率光源：
探测器
探测器是Pi Imaging公司的SPAD512² SPAD图像传感器，像素为512x512。该传感器可通过纳秒级的全局曝光进行时间分辨检测，并能以皮秒级的精度相对于激光脉冲进行移动。该传感器采用微透镜，提高了填充因子，整体计数率高达15Gcps。
| SPAD512² Standard* | SPAD512² High-Speed* | |
| 最大光子探测概率 | 50%@520nm | 50%@520nm |
| 填充因子 | > 50% | > 50% |
| 最大帧速率（8bit） | 270 fps | 400 fps |
| 最大像素计数率 | 70 kcps | 100 kcps |
| 最小门控宽度 | 6 ns | 6 ns |
| 最小门控步长 | 17 ps | 17 ps |
*通常情况下，套件默认包括标准版本，如需高速版本，请提前问询。
软件
分析软件 NovaLITE 读取单个门控衰减测量值，并进行平均寿命、相位和拟合分析。用户可以直观地将寿命显示为直方图或相位图。通过 GPU 加速拟合，可在数秒内根据固定寿命拟合单次或多次指数衰减和物种分离。结果可导出为 TIFF 格式，以便进一步处理。请注意，NovaLITE 是一款纯粹的分析软件，数据采集由 SPAD512² 软件处理，用户可通过远程接口将其集成到显微镜中。PicoQuant 的分析软件使用通用的 TIFF 文件格式。这不是 SPAD512² 采集软件的默认格式，文件需要转换。
请联系我们，配置适合您需要的套件 。
套装包含：
- 一个或多个激光器，用于所需波长的脉冲照明
- 512x512 像素 SPAD 阵列探测器（PI Imaging 公司的 SPAD512²高速单光子相机）
- 用于执行快速 FLIM、拟合和相位分析的分析软件
- 技术和应用驱动远程支持
使用阵列探测器的门控FLIM原理
在共聚焦 FLIM 中，通过扫描像素来依次获取寿命图像。每个像素中的寿命信息与 TCSPC 检测并行获取，从而构建寿命直方图。相比之下，在门控 FLIM 中，整个图像是并行采集的。然而，寿命信息是通过相对于荧光寿命衰减移动门来依次获取的。时间分辨率是通过丢弃落在门外的光子生成的。因此，成像速度、时间分辨率甚至总探测效率都取决于采集参数，其方式比共焦荧光成像技术更为复杂。
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共聚焦FLIM
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门控FLIM
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