激光扫描共聚焦显微术是先进的分子和细胞生物学研究技术。激光扫描共聚焦显微镜是在传统荧光显微镜成像的基础上,采用激光作为光源,使用激光扫描装置和共轭聚焦装置,利用微机控制的数字化图像采集和处理的技术。使用共聚焦显微镜,研究者能够采集组织或细胞内部的荧光标记信号、在亚细胞水平观察重要离子浓度的变化、观察组织或细胞的形态学变化和内部微细结构、对样品进行断层扫描并重构和分析组织或细胞的三维空间结构等。目前激光扫描共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究的重要手段。
蔡司(ZEISS)公司的LSM 510 META可以通过META通道(分光光栅和32个高灵敏度PMT检测器)对样品的各段波长信号进行同时快速采集。使用Emission Fingerprinting技术对光谱进行精确分析,可以区分发射光谱高度重叠的荧光标记物信号。META技术在共聚焦显微镜的应用适合目前不断发展的新荧光标记技术的应用(如多荧光蛋白标记等),使对细胞荧光信号的动态分析更方便和高效,如FRAP,FRET分析等,为生命科学研究提供了更加灵活多样的方法。
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子,在经过一个很短的激发态寿命后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个 1/2波长的光子的单光子激发相同。因为双光子激发需要很高的光子密度,所以为了不损伤细胞,双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲宽度只有 100 飞秒,而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时,双光子激发只发生在物镜的焦点上,所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔,提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点:1)长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本;2)焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面,使激发光可以穿透更深的标本;3)长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小;4)使用双光子显微镜观察标本的时侯,只有在焦平面上才有光漂白和光毒性等,所以双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本和活细胞及进行定点光漂白实验。
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