| 产品及特点 |
易错PCR（Error-Prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。很多时候，用户需要通过易错PCR得到不同突变数的DNA片段。为满足此需求，本公司开发是了可调易错PCR试剂盒。在实用过程中，发现易错PCR循环数很难优化，PCR循环数过多或过少都得不到清晰的DNA条带用于后续回收和克隆。本公司继续改进并推出染料法实时可调易错PCR试剂盒，它具有下列特点：
- 即开即用，十分简单方便。
- 在荧光信号进入平台期即可终止循环，此时电泳就可以得到清晰的突变DNA条带，不需要盲目摸索，节约大量的时间。
- 实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2-8个突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
- 可用于连续易错PCR，只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
- 可以扩增的DNA片段更长，达到2kb，对于2kb以上的产物，建议分段扩增。
- 本试剂盒足够100次30mL体系的染料法实时易错PCR。
- 本产品只能用于科研。
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| 规格及成分 |
本产品采用五孔盒包装
| 成份 |
编号 |
规格 |
包装 |
| 5×染料法实时可调易错PCR Mix（含dNTP） |
230713a |
600 mL |
0.5mL黄盖管 |
可调易错PCR专用
Taq DNA聚合酶（5U/mL） |
211216b |
50 mL |
0.5mL红盖管 |
| 可调易错PCR专用MnCl2 |
211216c |
300 mL |
0.5mL紫盖管 |
| 可调易错PCR专用dGTP |
211216d |
300 mL |
0.5mL蓝盖管 |
| 10×可调易错PCR追加dNTP |
211216e |
300 mL |
0.5mL本色管 |
| 使用手册 |
211216sc |
1份 |
无 |
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| 运输及保存 |
低温运输，-20℃保存, 有效期为一年。 |
| 自备试剂 |
引物、DNA模板、常规PCR试剂盒。 |
| 使用方法 |
- 将引物稀释到10uM。引物也是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
- 用自备易错PCR引物和自备的常规PCR试剂扩增制备易错DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错PCR引物扩增所得，在易错PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。
- 将回收的DNA片段（模板）稀释到1ng/mL 、10ng/mL和100ng/mL三个浓度。注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，易错PCR体系最终DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，则突变DNA在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。故建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
- 根据每1000bp的预期突变数按下表确定30mL易错PCR体系中MnCl2和dGTP的用量（这是在模板DNA不超过1ng的前提下的数据）。表中的Mn表示可调易错PCR专用的MnCl2, dG表示可调易错PCR专用的dGTP：
| 预期突变数 |
2个 |
3个 |
4个 |
5个 |
6个 |
7个 |
8个 |
| Mn用量（mL） |
0 |
1.0 |
2.5 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
| dG用量（mL） |
0 |
0 |
0 |
1.0 |
2.0 |
3.0 |
4.0 |
- 设置30mL体系的可调易错PCR：第一次建议设置3个模板浓度。在3干净的PCR管中，分别加入下列成分。最后加可调易错PCR专用MnCl2：
| 成分 |
模板用量1 |
模板用量2 |
模板用量3 |
| 5×染料法实时可调易错PCR Mix |
6 mL |
6 mL |
6 mL |
可调易错PCR
专用dGTP |
根据上步
用量表表选择 |
根据上步
用量表选择 |
根据上步
用量表选择 |
| 自备DNA模板 |
1 mL
（1ng/mL） |
1 mL
（10ng/mL） |
1 mL
（100ng/mL） |
自备PCR引物
(10 mM each) |
1 mL each |
1 mL each |
1 mL each |
可调易错PCR专用
Taq DNA聚合酶 |
0.5 mL |
0.5 mL |
0.5 mL |
可调易错PCR
专用MnCl2 |
根据上步
用量表表选择 |
根据上步
用量表表选择 |
根据上步
用量表表选择 |
| 自备超纯水 |
补水到30mL |
补水到30mL |
补水到30mL |
- 按已经优化的常规PCR条件进行染料法实时易错PCR：
| PCR前变性 |
94℃ 3分钟 |
易错PCR
(60次循环，但操作时PCR应该在荧光信号进入平台期后结束，不一定要做满60个循环) |
94℃ 1分钟 |
| 60℃ 1分钟 |
| 72℃ 3-10分钟。在此步采集SYBR通道的荧光 |
注：由于易错PCR含高浓度的镁离子，因此容易形成引物二聚体，因此需要使用60℃这种较高的复性温度，以避免小片段扩增产物竞争性抑制PCR。易错PCR一般不需要热启动，也不需要在易错PCR结束后做延伸处理。易错PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多。但循环数过多或过少都不容易在电泳时形成清晰的DNA条带，没有条带就没法回收克隆。所以需要在荧光信号进入平台期后立即停止PCR。
- 染料法实时易错PCR结束后，取3mL电泳检查。
- 如果有预期大小的PCR产物，则用剩余的PCR产物进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。
- 如果需要提高突变率，可以选择上轮易错PCR产物为模板，再进行下一轮易错PCR。
- 如果迪一轮易错PCR没有得到预期大小的PCR产物或者扩增60次也没有荧光信号，可以按下列操作追加进行一轮追加PCR。
- 在PCR管中，加入3mL 10×可调易错PCR专用追加dNTP到27mL电泳剩下的第一轮易错PCR体系中（用了3mL去电泳），按下表进行追加PCR（chasing PCR）。注意追加PCR只做20次循环。
| 步骤 |
参数 |
循环数 |
| 追加PCR |
94℃ 1分钟 |
循环20次，但实际操作时，只要荧光信号进入平台期即可在72℃结束时终止PCR。 |
| 60℃ 1分钟 |
| 72℃ 1分钟，在此步采集SYBR通道的荧光 |
- 追加PCR结束后，再电泳检测。如果有条带，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以此轮追加PCR的产物为模板，再进行下一轮易错PCR。
- 如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。
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易错PCR试剂盒 |
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