| 产品及特点 |
人Y染色体上95%是男性特异区域，里面含和男性有关的基因。本产品就是以其中一个基因为靶分子，设计的探针法荧光定量PCR产品，专门用于检测样品中是否有人Y染色体存在，它具有下列特点：
- 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
- 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到10拷贝/反应。
- 提供阳性对照，便于排除假阴性实验。
- 提供男性DNA做阳性对照，提供女性DNA做阴性对照。
- 特异性高，引物是根据人Y染色体高度保守区设计，不会跟人的其他染色体的DNA发生交叉反应。
- 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量时其线性范围不少于5个数量级。
- 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
- 本产品只能用于科研。
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| 规格及成分 |
| 成分 |
编号 |
规格 |
包装 |
| 2×Probe qPCR MasterMix |
981201 |
0.5 mL |
0.5 mL本色盖 |
| 荧光PCR专用模板稀释液 |
180701 |
1 mL |
1.5 mL绿色盖 |
人Y染色体专一性
引物-探针干粉 |
yp15-001-SRY-ke |
50次 |
0.5 mL棕色管 |
人男性基因组DNA阳性对照
(1×10E4拷贝/μL) |
220146 |
50 μL |
0.5 mL黄色盖 |
人女性基因组DNA阴性对照
(1×10E4拷贝/μL) |
220123 |
50 μL |
0.5 mL蓝色盖 |
| 使用手册 |
sc15-001-SRY-ke |
1份 |
无 |
本产品采用5孔盒包装
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162 μL超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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| 运输及保存 |
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。 |
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| 自备试剂 |
样品DNA，超纯水。 |
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| 使用方法 |
一、稀释标准曲线样品（以10E0-10E4拷贝/μL这5个10倍稀释度为例）。
- 标记4个离心管，分别为3，2，1，0。
- 用带芯枪头分别加入45μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
- 在3号管中加入5μL 1×10E4拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E3拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在2号管中加入5μL 1×10E3拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E2拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在1号管中加入5μL 1×10E2拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E1拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 换枪头，在0号管中加入5μL 1×10E1拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E0拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
- 上面的操作得到0-3号标准曲线样品，将试剂盒提供的人男性基因组DNA阳性对照(1×10E4拷贝/μL)当成4号样品，共5个样品，放冰上待用。
二、样品DNA的制备
- 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用确定的男性样品作为PC。用确定的女性样品作为NC。
- 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+8个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（试剂盒提供的女性DNA样品），5个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（试剂盒提供的女性DNA样品），1个用于PCR阳性对照（试剂盒提供的男性DNA样品）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
- 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分 |
样品管
N+2个 |
PCR阴性对照 |
标准曲线样品管
（0-4号管） |
| 2×Probe qPCR MasterMix |
各10μL |
10μL |
各10μL |
人Y染色体专一qPCR
引物-探针混合液 |
各4μL |
4μL |
各4μL |
| N+2个待测DNA样本 |
各6μL |
不加 |
不加 |
人女性基因组DNA阴性对照
(1×10E4拷贝/μL) |
不加 |
6μL |
不加 |
| 第7步所得标准曲线样品稀释液（0-4号） |
不加 |
不加 |
各6μL（1号样到1号管，2号样到2号管…） |
| 过程 |
温度 |
时间 |
| 预变性 |
95℃ |
5 min |
PCR反应
（45个循环） |
95℃ |
15 sec |
| 60℃ |
1 min（采集FAM通道的荧光信号，TAMRA为淬灭基团） |
四、数据处理
- 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须没有读数，或者大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。对待测样品，如果其Ct没有读数、大于或等于40则均为阴性，如果小于40则为阳性。
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| 关联产品 |
人Y染色体性别决定区染料法PCR检测试剂盒 |
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