在微液滴内,微生物分泌酶与底物反应,或裂解后释放酶与探针反应,产生荧光(pL 液滴作单细胞酶反应器体系,通量无限制)
4、阳性液滴分选
基于荧光信号分选阳性液滴(1 h 可分选近百万单克隆细胞,单次可分选百万至千万克隆)
5、载体回收及再转染验证
阳性质粒回收并进行下一轮筛选
应用方向
药用酶:布洛芬酯水解酶、TNA 聚合酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、缩醛酶......
分子酶:聚合酶、DNA 链接酶、限制性内切酶、置换酶......
造纸工业用酶:纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、漆酶......
食品工业酶/饲料工业酶:淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶......
环境污染处理酶:PET 酶、漆酶、辣根过氧化物酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、嗜酸酶、嗜碱酶、嗜热性酶......
药用催化酶:酮还原酶、转氨酶、亚胺还原酶、水解酶、氨基酸脱氢酶......
更多其他酶:兼容各种可利用激活分子探针、生物传感器、化学发光法检测的酶进化
应用案例
药用酶进化筛选 缩醛酶
本研究基于超高通量液滴微流控筛选系统技术,以甲醇做荧光底物,将突变的缩醛酶表达载体与底物、裂解液包裹成单细胞液滴,之后筛选系统基于液滴荧光信号对阳性液滴富集,通过此方法可以将先前优化的人工醛缩酶活性额外提高 30 倍,从而提高 >109 的速率,可以与 I 类醛缩酶的效率相媲美。进化出的缩醛酶,催化可逆醛醇反应具有高立体选择性,且耐受底物广泛。
(DOI: 10.1038/NCHEM.2596)
药用催化酶进化筛选 环己胺氧化酶
本研究基于高通量筛选系统,设计了通过 HRP 催化下游荧光底物氧化的荧光检测法,建立了一种多功能的超高通量微流控酶进化方案。该方法能从高达 107 文库中筛选出功能性氧化酶。与常用方法相比,超高的吞吐量一轮定向进化即可完成环己胺氧化酶的活性位点重构筛选,获得的酶催化效率提高了 960 倍,为非天然底物提供了具有野生型活性水平的酶,使生物催化合成具有完全立体控制及空间要求的药物中间体成为可能。酶偶联分析法无需标记,更易于任何重组氧化酶的进化。
(https://doi.org/10.1038/s41929-019-0340-5)
分子酶进化筛选 TNA 聚合酶
本研究中,作者开发了基于微液滴分选技术的体外聚合酶进化方法。筛选时,通过设计检测扩增全长模板的 CY3(F)-IOWA(Q) 报告探针检测酶活性对酶进化。
为进化不依赖于 Mn2+ 的 TNA 聚合酶,作者构建了容量为 8000 的聚合酶文库,经一轮选,最终筛选出 3 个不依赖于 Mn2+ 细胞株,其中 9n-YRI 表达的 TNA,对模板的复制在无 Mn2+ 时,突变降低了 50 倍。
本研究证实了锰离子降低 TNA 合成保真度的假说,并在更接近自然 DNA 合成的条件下,为获得高保真的 TNA 提供了一个可行高通量筛选策略。
(DOI: 10.1038/NCOMMS11235)