Uncle 多参数蛋白稳定性分析系统

Uncle是一个检测稳定性的一体化平台，可通过一台仪器实现12种不同的应用。它采用荧光，静态光散射（SLS）和动态光散射（DLS）的检测方法表征蛋白质稳定性（图1）。 多种检测方法意味着可以对同一种样品进行多参数检测，例如热熔，聚集和颗粒大小。 为了得到完整的信息，需要同时采用光散射和荧光的检测方法，即使聚集掩盖了蛋白质颗粒的变化，荧光也可以检测到蛋白质的展开。另外，温度控制（15-95°C）和样品的密封性也为样品的表征提供了更大的灵活性。样品加入到小体积的石英Unis管中，一次可以运行48个样品，因此可以更彻底地表征更多的生物制剂和配方。
 

1. 半数变性温度（Tm）

通过内源性荧光直接检测蛋白质的展开，确定其熔解温度。随着蛋白质的展开和氨基酸的重排，色氨酸和酪氨酸的荧光变化表明蛋白质的构象发生变化。内源性荧光是直接观察蛋白质解折叠的方法之一，即使在聚集开始后也可以这样检测，这与基于光散射或量热法的方法不同。这种检测方式可以对构建体的稳定性进行排序或比较不同的配方以获得最有利的条件。在大多数情况下，随着蛋白质的展开，荧光强度会发生变化或峰值漂移。但这种检测方式也有很多例外，最好的方式是对数据进行分析。Uncle检测完整的荧光光谱，以确保拥有所需的所有数据，并以您需要的所有方式进行分析。
 
Uncle通过直接测量内在荧光的展开来确定蛋白质的熔化温度。随着蛋白质的展开和氨基酸的重排，色氨酸和酪氨酸的荧光变化表明其构象也发生变化。固有荧光是观察蛋白质解折叠的唯一直接方法之一，即使在聚合开始后也可以这样做，这与基于光散射或量热法的方法不同。 在大多数情况下，随着蛋白质展开，荧光强度发生变化或峰值漂移。 但也有例外的时候，最好的方法是对数据进行系统性分析。Uncle测量完整的荧光光谱，以确保拥有需要的所有数据，并以您需要的方式进行分析。
 
2.聚集起始温度（Tagg）
通过在两个不同波长下使用SLS同时检测小颗粒和大颗粒，了解蛋白质在热升温过程中如何以及何时聚集，可以对您的构建体或制剂进行排序，找到防止或延迟聚集开始的辅料。 由于蛋白质可以展开也可以聚集，因此同时检测Tm和Tagg可以方便确定蛋白何时展开，以及导致聚集的原因。 使用不依赖颗粒大小变化的荧光方法，即使在聚集已经开始之后也可以测量Tm。

1. 用SYPRO荧光染料检测半数变性温度

差示扫描荧光测定法（DSF）是确定熔融温度的经典高通量方法之一。蛋白质可与外在染料如SYPRO^®Orange结合使用，当它与未折叠蛋白质的疏水表面结合时，会发生热变换。 该应用可用于蛋白质中很少或没有色氨酸残基的情况，或评估浓度非常低的蛋白质稳定性的情况。 与Uncle上的其他所有应用程序一样，该软件简化了数据分析，以节省时间。 

 
4.△G（吉布斯自由能变）
强制降解是室温稳定性评估的既定替代品，但热升温方法并不总能区分相似稳定性的条件。 对于这些棘手的问题，ΔG值可提供蛋白质稳定性的定量检测，它可在正交应力条件下测量。 通过将蛋白质暴露于化学变性剂中并测量其所产生的荧光变化，可以计算蛋白构象展开所需的能量。

1. 等温稳定性

等温稳定性是稳定性评估的另一种方法。不是将温度升高以引起熔化转变，而是将样品在略低于预期Tm的温度下保持更长时间。 将样品密封在Uni比色管中，温度可保持数小时或数天而不会蒸发。选择在荧光和SLS模式下同时检测样品的构象展开和聚集，如果想了解分子或聚集体的大小如何随时间变化，请选择DLS。

 
6.热变性恢复
热变性恢复可以检测蛋白构象展开的可逆性，或监测温度变化如何影响分子。选择一个温度（或几个），并上下升高，观察蛋白质是否可以在选择的制剂中重新折叠。选择荧光，SLS模式同时检测蛋白构象展开，重折叠和聚集。如果想监测蛋白质的构象随着流体动力学粒径大小和时间的改变，可选择收集DLS数据。
 
7.粒度与多分散性系数
DLS是一种高灵敏度的工具，用于测量溶液中蛋白质和小分子的流体动力学粒径大小。 Uncle的灵敏度符合行业最高标准，可以在低至0.05mg/mL的浓度下检测蛋白质的大小。 使用DLS可以识别聚集体或杂质的存在，并确认分子是否是期望的大小。另外，可以15-95°C之间的任何温度下获得粒径信息。
多分散性是样品不均匀性的衡量标准，如果颗粒尺寸不均匀，将检测到较高的多分散性值。 低多分散性值表明颗粒尺寸更均匀。Uncle在检测粒径的同时不使用任何额外的蛋白质或添加任何时间，即可获得有关多分散性的更多信息，并可在相同样品上进行其他实验。
 
8.升温粒度
确定或确认生物制剂热稳定性的另一种方法是用DLS测量蛋白质的流体动力学粒径大小，因为蛋白粒径在热应激下会经历构象变化。通过DLS测量粒径的增加是蛋白构象展开的证据。然而，在聚集开始后，仅用光散射不能确定真正的熔融温度。 Uncle的多种检测模式可更清晰地了解蛋白质构象的展开和聚集，从而可靠地监测蛋白质的构象变化。
  

9．kD：（扩散相互作用系数）
Uncle能确定蛋白质在不同配方中的扩散相互作用系数，以帮助预测其胶体稳定性或聚集的可能性。在结构和制剂配方缩小到更小范围后，使用这种非侵入式技术可以验证优化后的条件。另外，只需一次实验和几分钟的时间即可以同时获得B₂₂值。

10.B₂₂：（第二维里系数）
第二维里系数是研究样品中蛋白质分子之间相互作用的既定且有价值的方法。在测量k_D的同时，使用完全相同的样本，即可获得独立计算的B₂₂测量结果，通过它帮助预测蛋白质在制剂配方中的聚集倾向。正B₂₂值表示蛋白质分子之间的净排斥力，而负B22值表明蛋白质易于自我结合。

11.G₂₂ : (Kirkwood-Buff Integral)
G₂₂是一种更严格的检测蛋白质的净自身相互作用参数的方法，特别是在高浓度时，G₂₂可以确定样品中的蛋白质-溶剂和蛋白质-溶质相互作用。与B₂₂不同，阴性G₂₂值表示蛋白质分子之间的净排斥力，而阳性G₂₂表示可能的自结合。这节省宝贵的样本和时间，可以对B₂₂数据重新分析，以获得在蛋白高浓度时的G₂₂值。

黏度

Uncle可以比较不同蛋白质的黏度，并在制剂开发过程中更早地了解配方成分或赋形剂如何增加或降低溶液的黏度。Uncle需要的样品量比传统的粘度计小，因此可以用更少的蛋白质筛选更多的条件。

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