人IgA酶联免疫法

英文品名：Human IgA ELISA
中文品名：人IgA酶联免疫法
产品代码：0801197
规格：96人份/盒
储存条件：将所有试剂盒试剂储存在2-8℃。请勿冷冻。未使用的微孔板条应保存在带有干燥剂的密封袋中，尽量减少暴露于湿气中。
预期用途：该试剂盒是一种快速、易于使用的酶联免疫吸附试验（ELISA），用于测量血清、血浆、细胞培养上清液或其他生物液体中的人IgA。该检测方法包含即用型试剂，操作时间不超过两小时。试剂盒仅用于科研目的。
检验原理：涂有人IgA多克隆抗体的微孔板孔构成了该试验的捕获阶段。捕获的人IgA与辣根过氧化物酶结合的多克隆抗人IgA检测器抗体反应。
实验材料：
提供的材料：
- 微孔板，（1x96孔）： 涂有纯化的山羊抗人IgA的条形板
- 检测器抗体（12 mL）： 含有共轭的山羊抗人IgA过氧化物酶
- 人IgA校准品（7 mL）： 包含人IgA和检测稀释液
- 检测稀释液（100 mL）： 包含PBS、Triton X-100®和2-氯乙酰胺
- 洗板缓冲液（125 mL）： 含PBS、Tween 20®和2-氯乙酰胺
- 底物（12mL）： 包含TMB
- 终止液（12mL）： 专有配方
- 微孔板封板器（1包）： 每包10个封口器
- 塑料袋（1袋）： 用于储存未使用的微孔板条
® Triton X-100是Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.的注册商标。Tween 20是帝国化学工业公司的注册商标。
 
自备的材料：
- 一次性手套
- 用于制备样本和IgA标准稀释液的试管和架子
- 经过验证的可调微吸管，单通道和多通道*
- 蒸馏水或去离子水
- 刻度量筒和各种烧杯
- 经过验证的微孔板阅读器
- 自动微孔板清洗机或手动真空吸液设备
- 计时器
注意事项：
仅供科研使用。不得用于诊断程序。
- 在进行检测之前，请仔细阅读所有说明。
- 在处理试剂盒成分和测试样本时，应采取通用预防措施。
- 为避免交叉污染，对每个样本使用单独的吸头。
- 在测试具有潜在传染性的样本时，应遵守所有适用的地方、州和联邦关于处理生物危险品的规定。
- 终止液含有盐酸，可能导致严重烧伤。如果接触到眼睛或皮肤，请立即用清水冲洗并寻求医疗援助。穿戴防护服和眼镜。
*MMWR, June 24, 1988, Vol. 37, No. 24, pp. 377-382, 387-388
试剂准备：
-洗板缓冲液：使用前用蒸馏水或去离子水1:10稀释10X平板洗涤缓冲液。充分混合。制备好的1X洗板缓冲液可在2-8℃储存一周。如有需要，可订购额外的10X洗板缓冲液（ZEPTOMETRIX目录#：0801060）。
-人IgA标准曲线：如表所示。人IgA校准品的浓度为125 ng/mL。该校准品应在检测稀释液中按以下方法稀释，以制备标准曲线。

试管序号	人IgA浓度	人IgA校准品的容积	检测稀释液的容积
1	125 ng/mL	1000µL	0µL
2	62.5 ng/mL	500µL#1	500µL
3	31.25 ng/mL	500µL#2	500µL
4	15.6 ng/mL	500µL#3	500µL
5	7.8 ng/mL	500µL#4	500µL
6	0 ng/mL	0µL	500µL

样本稀释：
人血清和血浆样本通常含有0.6-4.0毫克/毫升的IgA。因此，建议用1:40,000的稀释液对样本进行初步测试。初次测试后，可能需要调整待测抗体溶液的浓度，浓度在125纳克/毫升和7.8纳克/毫升之间以便准确定量。
检测程序：
在使用前让所有试剂达到室温。对用于制备校准品和样本的试管进行标记。如果不使用整个96孔板，请从板框上取下多余的条带，放入可重新密封的带干燥剂的塑料袋中并储存在2-8°C。
第1步：在其末端选项卡上标记每个条带，以确保在条带从板框上分离时的身份测定。
第2步：在平板上指定一个孔并留空。该孔将作为底物空白。
第3步：将200µL的校准品#1-6移入重复的孔中。
第4步：将200µL的每种样本移入重复的孔中。
第5步：用封板器盖住微孔板，在室温下孵化30分钟。
第6步：吸出每个孔的内容，用300 µL的1X洗板缓冲液洗涤并吸干。进行4次填充/吸液循环。在最后一次清洗循环后，通过在吸水纸巾的垫子上小心地敲击平板彻底擦拭平板。继续进行，直到没有可见的洗板缓冲液液滴。
第7步：将100µL的检测器抗体移入每个较准孔和样本孔。不要将检测器抗体加入底物空白孔中。
第8步：用封板器盖住平板，在室温下孵育30分钟。
第9步：如第6步所述，用洗板缓冲液洗板4次。
第10步：将100µL底物移入每个孔，包括底物空白孔。
第11步：将微孔板在室温下孵化30分钟。在含有人IgA的孔中会出现蓝色的颜色。
第12步：将100µL的终止液移入每个孔中。颜色会从蓝色变为黄色。
第13步：在15分钟内，用微孔板阅读器在450纳米处读取每个孔的光密度。
结果的计算和解释：
1. 计算每组校准品和稀释后的样本的平均光密度（OD）值。
2. 使用线性图画纸或绘图软件，在Y轴上绘制每个校准品的平均OD值与X轴上相应的校准品浓度的对比。
3. 通过这些点画出最佳拟合曲线，构建标准曲线。在大多数情况下，线性回归图就足够了。
但为了获得最准确的结果，请使用点对点或四参数逻辑回归。
4. 通过标准曲线的内插法确定每个稀释的样本的IgA浓度。
5. 乘以用于稀释每个样本的稀释系数，以确定原始样本的IgA浓度。
测试的有效性：
- 为了使测试有效，0 ng/mL校准品和底物空白的平均光密度必须低于0.200。
- 125 ng/ml的平均光密度必须高于1.000。
- 当平均光密度值不在标准曲线范围内时，建议用更大或更小的稀释度重新测定样本。
预期结果：
下面是一个标准曲线的例子，不用来计算实际的样本。由于移液、孵化器温度、读板器等原因，不同的实验室可能会出现不同的变化。

人IgA 校准品浓度	450nm光密度
125 ng/mL	2.028
62.5 ng/mL	1.216
31.25 ng/mL	0.687
15.6 ng/mL	0.377
7.8 ng/mL	0.220
0 ng/mL	0.062

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