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死细菌活细菌染色试剂盒（Syto9-PI法）

英文名称：	SYTO9-PI Live and Dead Bacteria Stain Kit	总访问：	624
国产/进口：	国产	半年访问：	91
产地/品牌：	江苏/天净沙	产品类别：	分子生物学试剂
规格：	40次	最后更新：	2025-2-21
货号：	11-MK220950-40
CAS 号：
参考报价：	2190-2597
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销售商：北京天净沙基因科技有限公司

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产品介绍
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产品详情请浏览官网：
http://www.tjs.bio/productDetails.html?id=11328

产品及特点

活细菌死细菌双染试剂盒（SYTO9/PI法）是利用SYTO9绿色核酸染料和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染料来进行细菌活力检测的试剂盒，其原理是SYTO9能对所有待测细菌（活菌+死菌）进行标记，而PI只能渗透进入到细胞膜受损的死菌，故在活菌中只有SYTO染料，故呈绿色荧光，而在死菌中同时有SYTO9和PI两种染料，故细菌呈红色荧光。在荧光显微镜下通过颜色即可分开两类细菌，通过检测两种荧光的比例可以反推出样本中活菌和死菌的比例。本方法原理示意图如下：

本产品基于上述原理开发，它具有下列特点：
1. 适用于各种细菌，包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等等。
2. 两种染料的最大激发和发射波长分别是480/500nm（SYTO9）和490/635nm（PI）。
3. 本试剂盒兼容于荧光显微镜，荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或其它荧光检测仪器。
4. 本产品足够40次1mL细菌的荧光显微镜检测和流式细胞仪检测，200次100uL菌液的荧光酶标仪检测。
5. 用于定量时需要自备制作标准曲线的细菌。
6. 本产品只能用于科研。

规格及成分

成份	编号	规格	包装
SYTO9溶液，3.34mM	11-MK220950a	60 μL	0.5mL棕色管
PI溶液，20mM	11-MK220950b	60 μL	0.5mL棕色管
Mounting oil	11-MK220950c	2 mL	2.0mL本色盖
使用手册	11-MK220950sc	1份	无

本产品使用五孔盒包装

运输及保存

低温运输，-20℃避光保存，有效期一年。

自备试剂

0.85%NaCl溶液，细菌培养基（制作标准曲线用，培养基跟所测细菌种类相关）

使用方法

一、用前须知
1. 第一次使用可将SYTO9和PI室温融化，低速短暂离心，然后根据单次用量分装成小份密封后置于≤-20℃避光保存。
2. 组分C（Mounting oil）用于将细菌固定在膜上，25℃的折射率是1.517±0.003。不要误用作显微镜的浸油（Immersion oil）。
3. SYTO9和PI均能够跟核酸结合，PI是已知的潜在诱变剂，目前没有数据表明SYTO9的诱变性或毒性，两种试剂使用都需做恰当防护。含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进行废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。
二、制备活菌和死菌悬液（制作标准曲线用或对照用）
4. 用30mL营养肉汤培养大肠杆菌或其他细菌，使其生长至对数生长后期。
5. 于10000×g离心10分钟，吸弃上清液。
6. 用2mL自备的0.85% NaCl溶液重悬细菌沉淀。
7. 取1mL重悬菌液加入到20mL 0.85% NaCl溶液中（用作活细菌对照），另外1mL加入到20mL 70%异丙醇中（用作死细菌对照）。
8. 两管样品于室温孵育1小时，每隔15分钟颠倒混匀一次。
9. 两管样品于10000×g离心10分钟。
10. 分别用20mL 0.85% NaCl溶液重悬两管细菌沉淀。
11. 于10000×g离心10分钟，吸弃上清液。
12. 分别用10mL 0.85%NaCl溶液重悬两管样品得到活菌和死菌样品。
13. 分别取3mL菌液测定OD670的值（可用玻璃或丙烯酸酯比色皿，1cm路径）。
14. 根据不同后续实验进行下面的操作。
三、荧光显微镜检测
15. 在离心管内将SYTO9溶液和PI溶液按1：1的体积比混匀得到染料混合液。
16. 取1mL活菌悬液和1mL死菌悬液（来于第13步），各加入3μl染料混合液混匀，此作为活菌和死菌对照。同时，用0.85%NaCl溶液将待测样品制备成1mL悬液，也加入3μl染料混合液混匀。
17. 室温避光孵育15分钟。
18. 各取5μL染色的细菌悬液到载玻片上，并盖上18mm方形盖玻片后在荧光素滤光片下观察活菌（绿色荧光）和Texas Red滤光片下观察死菌（红色荧光）。
四、荧光光度计检测（以大肠杆菌为例）
19. 调整大肠杆菌活菌悬液和死菌悬液，使其密度均为1×10E8个细菌/mL（OD670=0.03）。
20. 按下表制备标准曲线样本：

样本号	加入活菌mL	加入死菌mL	活菌比
1	0	3	0%
2	0.75	2.25	25%
3	1.5	1.5	50%
4	2.25	0.75	75%
5	3	0	100%

21. 如果有N个待测样品，则准备（N+6）×9μL染料混合液A。染料混合液A由SYTO9溶液和PI溶液1：1充分混匀而成。多准备的5个用于标准曲线样品，多1个的量为富余量。
22. 在N个样品管和1-5号标准曲线样品内各加入9μL染料混合液A，用枪上下吹打数次使其混匀。
23. 室温避光孵育15分钟。
24. 以485nm为激发波长，530nm为发射波长（emission 1，绿色）来测定每个样品的绿色荧光，得到荧光值G。
25. 以485nm为激发波长，630nm为发射波长（emission 2，红色）来测定每个样品的红色荧光，得到荧光值R。
26. 计算每个样品的荧光比值G/R。
27. 以1-5号样大肠杆菌活菌比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比（RatioG/R）为纵坐标，制作标准曲线，用待测样品G/R比值倒推出其活菌比。
五、荧光酶标仪检测（以大肠杆菌为例）
28. 调整大肠杆菌活菌悬液和死菌悬液，使其密度均为1×10E8个细菌/mL（OD670=0.03）。
29. 按下表制备标准曲线样本：

样本号	加入活菌mL	加入死菌mL	活菌比
1	0	2	0%
2	0.5	1.5	25%
3	1.0	1.0	50%
4	1.5	0.5	75%
5	2	0	100%

30. 用0.85%NaCl溶液将测样品的细菌（死菌+活菌）浓度调到1×10E8个细菌/mL待用。
31. 如果有N个待测样品，每个样品做三次重复，则需要准备3×（N+6）×100μL染料混合液B。多准备的5个用于标准曲线样品，1个为富余量。
32. 染料混合液B配制（以1mL为例）：3uL SYTO9溶液加3uL PI溶液，再加入2 mL无菌水，充分混匀后即可。
33. 每个样品各取100μL悬液到一个96孔板中，每个样品做三个平行样（每个样品用三个孔）。96孔板的边缘孔空置以避免假读数。
34. 更换新的枪头，每孔加入100μl染色混合液B，上下吹打使充分混匀。
35. 室温避光孵育15min。
36. 以485nm为激发波长，530nm为发射波长（emission 1，绿色）来测定每孔荧光，得到荧光值G。
37. 以485nm为激发波长，630nm为发射波长（emission 2，红色）来测定每孔荧光，得到荧光值R。
38. 计算荧光比值G/R。
39. 以1-5号样大肠杆菌活菌比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比（G/R）为纵坐标，制作标准曲线，用待测样品G/R比值从标准曲线上倒推出其活菌比。

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