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【上海精瑞科学仪器有限公司 BIA Separations 中国区代理】一家专业提供HPLC色谱柱、GC色谱柱、SPE前处理小柱和其他实验室常用耗材、配件的公司,同时提供各种进口标准品和各类分析仪器
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QQ：3295336257
BIA Separations是整体色谱柱*的开发商和制造商,为生产、纯化、和分析生物大分子提供新的解决方案，是*能提供满足生物、医药行业研究和生产需要的生物大分子整体色谱柱的欧洲公司，公司致力于成为创新的生物色谱领域的 。
BIA公司总部在斯洛文尼亚，设有研发、生产和销售部门，在美国和亚洲设有销售办事处。
BIA公司开发和生产*质量的整体柱, 并提供*的研究和生物分子的纯化和分析方法开发服务。
上海精瑞科学仪器有限公司成为BIA Separations中国区合作伙伴，将帮助BIA全线产品和技术在中国推广，为用户提供完备的售前及售后技术服务。
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2012年成为 SDK Corporation (Shodex)公司的战略合作伙伴(该公司市值达90亿美元,总部设在日本）
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已经通过FDA认证（根据美国GMP规定），JAZMP认证（根据欧盟GMP规定），ISO 9001: 2008 等认证
一、monolith整体柱
BIA Separations公司的monolith整体柱，是在柱管内原味聚合成具有多孔结构的连续整体高聚物材料，因此与传统装填柱相比，
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整体柱具有渗透性好、柱前压低、活性位点利用率高，峰容量高等优点；
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整体柱中既有流动相的流通孔又有便于溶质进行传质的中孔（几十个纳米）
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因而可以对生物大分子进行快速分离 （生物大分子特性在传统色谱柱中不能完全接近固定相表面）。
二、CIMmultus™制备柱
BIA的 CIMmultus™制备柱是一种新型改进的预包装色谱整体柱，其特点是：
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大流量通道，可用于处理大蛋白（IgG，IgM，PEG化蛋白），（AAV，腺，慢，，噬菌体） ，VLPs和pDNA；
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CIMmultus™色谱柱符合cGMP标准。
该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计，可实现快速操作，高流量，同时提供动态结合能力和分辨率。
首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤，准备细菌培养液
1. 大肠杆菌收获、裂解－碱裂解：
这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。
操作建议：
先收集菌体；
然后采用碱性裂解法制备原料；
再将细菌细胞（通常是细胞生物质或细胞沉淀）悬浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；
通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 进行裂解。
2. 裂解液浓缩：
氯化钙沉淀后澄清，除去了大量的主要样品杂质
裂解后，悬浮液变粘稠，通过加入与悬浮缓冲液等体积的，4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。
在温和混合下，缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。
TIPS:
1. 氯化钙用作沉淀剂，以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;
2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;
3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;
4. 加入速度应该很慢，以防止局部温度上升;
5. 孵育后，进行一系列澄清步骤，从离心或粗过滤开始，例如 80μm 深度过滤，并以 1-5μm 过滤结束。
（低温有利于沉淀，混合过程应该温和操作，以防止 DNA 降解。）
前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。
BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。
第一步纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；
第二步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。
两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。
AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。
在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。
随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。
层析条件
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Monolithic column: |
CIMmultus™ DEAE(2 µm)*1 |
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Mobile phase: |
Equilibration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 |
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Washing buffer A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M NaCl, pH 7.2 |
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Elution buffer A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.2 |
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Working flow rates: |
0.5 – 5 column volume (CV) /min (具体取决于样品特性，使用的层析设备和色谱柱尺寸) |
*1 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。
层析方法
1. 用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。
2. 将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。
3. 将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。
4. 将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。
5. 用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。
6. 用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。
7. 用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。
图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线
在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从 超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。
为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。
该步骤进一步去除了杂质。
层析条件
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Monolithic column: |
CIMmultus™ C4 HLD (2 µm)*2 |
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Mobile phase: |
Equilibration buffer B0: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2 |
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Washing buffer B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7 M (NH4)2SO4, pH 7.2 |
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Adjustment buffer: 4 M (NH4)2SO4 |
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Elution buffer B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4 M (NH4)2SO4 , pH 7.2 |
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Regeneration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 |
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Working flow rates: |
0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸) |
*2 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。
层析方法
1. 调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液，每 1 体积（V）洗脱液加入 3 体积（V）的 4M(NH4)2SO4。
2. 用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。
3. 将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。
4. 用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。
5. 用缓冲液 B2（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。
6. 用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。
7. 加样 3 次后，对柱子进行清洗。
图 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分离超螺旋质粒 DNA
· 从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋 pDNA 组份含有硫酸铵，必须在生物应用质粒之前将其除去。
· 缓冲液交换可通过透析滤过或体积排除色谱等方法进行。
· 配置和填充可能需要额外的处理。
二步法层析过程分析：
质粒 DNA 制造成功的关键是实时过程控制方法，确保最终产品中高百分比的超螺旋 pDNA。
CIMac™pDNA 分析柱可用于监测降解产物（开环和线性 pDNA），去除杂质（RNA），并确保每个生产步骤都能产生预期的超螺旋 pDNA 量。
CIMac™pDNA 分析柱还用于超螺旋质粒 DNA 含量的质量控制。
图 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的质粒 DNA 亚型含量的质量控制
结果和结论：
通过优化裂解、沉淀和两种色谱步骤相结合，可生产满足所有监管要求的纯 pDNA。
可以完成去除 99% 以上的主要杂质（RNA，基因组 DNA，宿主细胞蛋白，内毒素和开环 pDNA）。
此外，快速（大肠杆菌的 pDNA 提取和纯化可在几小时内完成），可重复的过程可降低运营成本并提高工厂生产率。
独特的整体特性有助于该过程的直接可扩展性，涵盖从小规模实验室到大规模工业纯化 pDNA 的生产水平。
Table 1: Process results.
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Process yield |
> 80 % |
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A260/280 |
1.92 |
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Homogeneity (SC pDNA) |
> 97 % |
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HCD – removed |
> 99.5 % |
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HCP - removed |
> 99 % |
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Endotoxin |
< 2 EU/mg pDNA |
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RNA - removed |
> 99 % |
点评
目前市面上有不少质粒纯化工艺方案，但是比较下来，BIA 二步法纯化工艺具有两大优势：
效率明显提高
只需两步色谱和高流速的整体柱色谱方案，减少工艺步骤（提高回收率）并加快纯化速度，从而显著提高生产率。
灵活放大
由于特定的整体柱设计，质粒 DNA 过程可以快速扩展到更大的单位。
在 1 毫升色谱柱上设计的工艺可以轻松转移到试验和生产规模。
在 8L 色谱柱上单次运行可以产生 48 g 药物级 scDNA。
Table 2: Scale up options.
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Column size |
pDNA purified per cycle |
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1 mL |
6 mg |
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8 mL |
48 mg |
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80 mL |
480 mg |
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800 ml |
4.8 g |
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8000 mL |
48 g |
十多年来，BIA Separations 一直是高效率质粒纯化的好选择。它不仅提供整体柱和平台模板，还提供定制的纯化服务，以完全满足您的质粒 DNA 纯化需求。
三、CIMac™分析柱
BIA的CIMac™分析柱旨在用于大分子蛋白质，质粒DNA，样颗粒和噬菌体的快速且可重现的HPLC监测和定量。
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它们主要用于净化过程不同阶段的各种样品的过程和最终控制。
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它们可以在高体积流量下操作（从1到20个柱体积/分钟）;
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因此，有关产品数量和纯度的信息可以在几分钟内获得。
BIA的CIMmultus™制备柱和CIMac™分析柱是快速可靠的PAT（Process analytical technology）工具，可提供：
快速，高分辨率分析，在几分钟内就可以实现。
以聚合物为基体的Monolith HPLC柱可进行独立于流速的分离，无扩散、无微孔、无死体积，使流动相和固定相之间的传质非常迅速。
高灵敏度和可重复性。
