SM-005-P Minute™ 植物膜蛋白提取试剂盒

描述： 植物膜蛋白占植物细胞总蛋白的很小一部分，但是在植物生理学中起着非常重要的作用。传统的植物膜蛋白分 离纯化方法是蔗糖密度梯度离心法和双液相法。这些方法虽然比较有效，但是需要超高速离心和大量的起始原 材料，操作过十分繁琐和费时。为了克服植物膜蛋白提取中的缺点，我们特别开发了此款植物膜蛋白提取试剂 盒。植物组织首先通过缓冲液 A 中致敏，匀浆，然后通过一个特殊的离心管柱，在此过程中匀浆的组织通过柱 子特有的 Z 字形通路后细胞膜被切割成大小相等的碎片，后续无需超高速离心，通过差速离心法和密度梯度离 心法将天然的质膜蛋白从未破裂的细胞，细胞核，细胞质和细胞器的混合物中分离出来。在每次实验中仅需使 用相同量的起始材料，离心力和离心时间，即可高度富集膜蛋白，并保证一致性良好。整个操作过程大约 1 小 时可以完成。 
应用：
试剂盒用于快速从植物组织中分离天然膜蛋白，可应用于 SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，膜蛋白质 结构分析，2-D，酶活性测定及其他应用。
试剂盒组份（50 次）：
1. 25ml Buffer A
2. 10ml Buffer B
3. 50 个离心管柱
4. 50 个收集管
5. 2 根塑料研磨棒
6. 组织分离粉
储存：
Buffer A 和 Buffer B 需在-20℃储存
所需附加材料
1XPBS
涡旋震荡仪
台式离心机
重要产品信息
1. 仔细阅读整个操作说明。将缓冲液 A 和缓冲液 B 完全解冻后摇匀，放置于冰上。将离心管柱和接收管套管 放置于冰上预冷。
2. 离心机请调整成 RCF 模式，按照 Xg 离心，所有离心步骤都需要在 4℃室温下或者低温离心机中进行。
3. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制剂应在使用前加入缓冲液 A 中。蛋白酶抑制剂可以选择添加或不添加，如添 加在使用前加入缓冲液 A 中（请按照蛋白酶或磷酸酶抑制剂母液比例，例如母液是 100x，添加时按照 1： 100 添加，1ml 缓冲液 A 添加 10ul 抑制剂）。
4. 推荐使用 BCA 方法测定蛋白浓度。
5. 研磨方式请按说明书操作，请勿使用液氮研磨。
膜蛋白分离步骤
注：由于植物样品的多样性，不同样品合适的研磨方式是质膜分离的关键。
1. 将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷
2. A.大部分较软的植物组织样品，将新鲜组织或冷冻组织（200-300mg）切成小片（1-2mmX1- 2mm），放入离心管柱套管上，用 1ml 吸头反复挤压组织减少体积，称取 50-80mg 组织分离粉 加入离心管柱中，用塑料棒反复扭转研磨组织 1-2 分钟。加入 100ul Buffer A 至离心管柱中， 然后继续研磨几分钟，加 A 至满为止，开盖冰上孵育 5 分钟。接转步骤3。
B．含水量较多的组织样品(例如水果组织)，将大约 300mg 组织样品剪切成小块放入离心管柱 中，台式离心机最高速离心 1 分钟去除多余水分，然后按照上一条描述方法匀浆，匀浆后冰上 孵育 5 分钟，接转步骤3。
C. 对于比较坚硬组织（如根和水稻叶）的样品，匀浆步骤可在离心管柱外部使用研钵或类似 的匀浆装置进行。加入缓冲液 A（约 300-400μl）中匀浆后，将匀浆转移到离心管柱上接转步 骤 3。
3. 盖上盖子， 16,000Xg 离心 30 秒。（需要最短时间达到设定转速）
4. 弃去离心管柱，涡旋大力震荡 10-20 秒重悬沉淀。
5. 700Xg 离心 1 分钟（沉淀包括完整的细胞核和大的碎片）。
6. 将上清转移到新的 1.5ml 离心管中，4℃，16000Xg 离心 30 分钟（延长离心时间可以增加产 量）。弃去上清（上清为胞浆组份），保存沉淀（沉淀为总膜蛋白组份包括细胞器和质膜）。如果不 需要分离质膜做到此步骤即可，将总膜组份存储于-80 oC。如果需要分离质膜，请不要冷冻总膜组 份，继续第 7 步骤。
7. 加入 200ul Buffer B 用吸头反复吹打或涡旋震荡重悬第 6 步的总膜蛋白组份。4℃，7800Xg 离 心 5 分钟（注意：如果最终质膜组份中含有细胞器膜污染，此步骤离心时间可增加到 20 分钟提高 纯度）。沉淀部分为细胞器。
8.第 7 步离心后，小心的将上清液转移到新的 2.0ml 离心管中，加入 1.6ml 预冷的 PBS，盖上盖子 混匀几次。16000Xg 离心 30 分钟（延长离心时间可以增加产量）。弃去上清液，保存沉淀（沉淀 为质膜蛋白）。产量一般为每个样品 10-100ug。如需较大量质膜，可将几个质膜沉淀合并增加总 量。质膜蛋白可以根据下游实验需求用 20-200ul 含表面活剂的缓冲液溶解。推荐使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜蛋白。做等电聚焦（2D 凝胶第一维）我们建议使用：7M 尿素/2M 硫 脲/2%Chaps 和 20mM DTT (使用前将 DTT 加入以上混合液中)。

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