彗星试剂盒

产品编号：M001
包装规格：24T
产品简介
当各种内外源DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，DNA的超螺旋结构受到破坏，采用化学方法使细胞膜、核膜破裂，细胞内的蛋白质、RNA以及其它成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在碱处理和碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来，在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形成彗星状的图像，而未损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断片越多并且片段越小，电泳时迁移的DNA量也就越大，荧光显微镜下可观察到尾部荧光强度增强。
本试剂盒具有以下特点：

1. 采用单层凝胶体系，操作简便；
2. 采用特色涂层多孔载玻片，增加凝胶与载玻片粘附力，有效降低脱胶风险；
3. 凝胶经70%酒精脱水烘干后染色，有效解决镜检时不易聚焦的问题。

试剂盒组成

产品编号	组分	24T
-1	Comet Agarose	15ml
-2	Lysis Solution	100ml
-3	-Well Comet Slide	4
-4	10×Alkaline Solution	2
-5	*ropidium Iodide(PI)	1ml

保存：PI染色液需 4℃避光保存，其余试剂室温保存即可，有效期6个月。
注意事项

• 本产品仅限于科学研究使用。
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套和口罩操作。
• 为避免操作不当引起的脱胶，勿使溶液直接倾倒在玻片上，需将载玻片轻柔浸没在溶液中。

试剂制备

1. 自备试剂：1×PBS缓冲液(不含钙镁离子)、去离子水、无水乙醇、DMSO(可选)。
2. 拧松Comet Agarose试剂盖，90-100℃水浴使凝胶完全熔化(不建议微波加热)，转移至37℃水浴锅中放置，待温度冷却平衡后方可使用(需至少平衡20min)。
3. Lysis Solution使用前需4℃预冷至少20min，若长期保存，室温即可，4℃长期放置会有沉淀析出。(选做)对于富含亚铁血红素的样本(如血细胞、组织样本等)，Lysis Solution需额外添加10%DMSO(如45ml Lysis Solution+5ml DMSO)。
4. 解旋液配制：将10×Alkaline Solution用去离子水稀释后(如5ml 10×Alkaline Solution +45ml 去离子水)，室温放置备用。
5. 电泳液配制：将10×Alkaline Solution用去离子水稀释后(如50ml 10×Alkaline Solution +450ml 去离子水)，4℃冷藏备用。

操作说明

1. 样本处理：用冷的1×PB*缓冲液(不含钙镁)重悬细胞，调整细胞密度为4×10⁵个/ml。
2. 铺胶：按照1:10(v/v)将细胞悬液与熔化后的Comet Agarose(37℃)在EP管中充分混合(如10μl 细胞悬液+100μl Comet Agarose)，迅速吸取20μl混合液(约800个细胞)滴加至6-Well Comet Slide圆孔内，盖上圆形盖玻片，并用镊子轻轻按压，辅助凝胶延展至盖玻片边缘，4℃避光固化15min。
3. 裂解：胶凝固后，用指腹小心将盖玻片推开，并将载玻片转移至装有预冷的Lysis Solution的容器中，4℃裂解1h-2h，取出载玻片并沥去多余液体，蒸馏水浸洗2次，每次2min。
4. 解旋：将载玻片转移至装有新鲜配制的解旋液的容器中，室温解旋20min。
5. 电泳：水平电泳仪中倒入4℃预冷的电泳液，将载玻片轻柔浸没其中，按照1V/cm设定电压，在电流300mA条件下电泳15-30min(电流可通过改变电泳液液面高低来调节；)。
6. 中和及烘干：取出载玻片并沥去多余液体，蒸馏水浸洗2次，每次2min。转移载玻片至70%酒精溶液中，室温放置5min后取出沥干，37℃烘干15min至胶完全干燥。
7. 染色：每孔滴加40μl染色液，室温避光染色10min，蒸馏水浸洗2次，每次2min。
8. 观察及分析：荧光显微镜下观察，并进行图片采集。可使用彗星分析软件(如CASP，https://casplab.com/)，得出彗星尾长 (tail length of comet，TL)、彗星DNA比例(percent DNA in the tail，TD)、彗星尾距(tail moment，TM)等参数。DNA  损伤按慧星尾部 DNA  量占全部 DNA  量的比例可分为 5  级：

0  级： ＜ 5% 无损伤；
1  级： 5 ～20% 轻度损伤；
2  级： 20～40% 中度损伤；
3  级： 40～95% 高度损伤；
4  级： ＞ 95% 重度损伤。
示例

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