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| 销售商： 北京擎科生物科技有限公司 | 查看该公司所有产品 >> |
I-5™ 2×High-Fidelity Master Mix
超高保真度（Taq的60倍），极速延伸（5~15 s/kb）
【产品简介】
本产品为产品简介2×浓度的快速扩增PCR预混液，其中包含的I-5TM高保真DNA polymerase集超高保真度及超强扩增于一体，在扩增中展现出极高的准确率。本产品适用于基因克隆、SNP测序分析等对保真度要求较高的扩增实验。本产品包含DNA polymerase、Buffer、dNTP等组分，只需添加引物和DNA模板，并使用ddH2O补足体系即可进行PCR扩增。扩增完成后，可取适量扩增产物与6×Orange Loading Buffer按比例混合后，进行电泳检测。本产品扩增产物为平末端，若纯化后用于T/A克隆，推荐使用平末端克隆试剂盒（目录号：TSV-007B）。
【产品特点】
超高的保真度∶保真度为野生型Taq DNA polymerase的60倍;
极快的延伸速度∶10~15 s/kb;
超强的扩增能力∶兼容复杂模板、长片段扩增。
【适用范围】
适用于基因克隆、SNP测序分析等对保真度要求较高的扩增实验。。
【产品组成及保存】
-25~-15℃保存，保质期2年
| 组分 | 规格 |
| I-5™ 2× High-Fidelity Master Mix | 5×1.0 mL |
| 6 ×Orange Loading buffer | 2×1.0 mL |
【操作流程】
1. 在PCR管中配制如下反应液，混匀短暂离心后，上机反应。
| 25 µL 体系 | 50 µL 体系 | |
| I-5™ 2× High-Fidelity Master Mix | 12.5 µL | 25 µL |
| 10 µM Primer F | 1 µL | 2 µL |
| 10 µM Primer R | 1 µL | 2 µL |
| Template DNA | * | * |
| ddH2O | Up to 25 µL | Up to 50 µL |
注意过量模板容易导致非特异性扩增，过少模板容易导致PCR扩增效率低。
2. 反应程序
| 温度 | 时间 | 循环次数 | ||
| 1 | 预变性 | 98 ℃ | 2 min | 1 cycle |
2 |
变性 | 98 ℃ | 10 s | 25~35 cycles |
| 退火 | 45~68 ℃ | 10~15 s | ||
| 延伸 | 72 ℃ | 5~15 s/kb | ||
| 3 | 终延伸 | 72 ℃ | 1~5 min | 1 cycle |
【问题讨论】
Q1：收到PCR Mix后如何储存和使用？
A1：聚合酶应储存在-20℃的无霜冰箱中（可接受范围在-15℃~-23℃之间）。不建议在-70℃或-80℃下长期储存（超过一周）。酶不可以在室温下保存。在打开一管新酶之前，简单离心以集液于管底。
Q2：I-5TM 解冻时有时会看到管中有絮状物，影响扩增吗？
A2：这是PCR buffer中的活性物质，有时低温会导致其析出，只要PCR Mix完全融化后，轻轻震荡后即可溶解，不影响酶活和后续PCR扩增。
Q3：定点突变实验一般推荐使用什么产品，为什么？
A3： 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
点突变实验需保证序列的准确性，所以应该使用高保酶（推荐 I-5TM 2×High-Fidelity Master Mix，TSP001）进行扩增序列。另外，为提高成功率推荐搭配无缝克隆试剂SoSoo（TSV-S1），多点突变也可免去融合PCR的步骤，操作更加方便。
Q4：什么是Overlap PCR？什么酶适用于做Overlap PCR？
A4：Overlap PCR（重叠PCR）技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该技术成功的关键是重叠互补引物的设计。Overlap PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
为了保证做Overlap PCR时不引入额外突变，建议使用高保真酶扩增，推荐I-5TM 2×High-Fidelity Master Mix（TP001）。
【实例分享】
以两个油菜cDNA为模板，用I-5TM 2× High-Fidelity Master Mix扩增3.7 kb的目的条带。扩增产物特异性好，产量高。
