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禽流感病毒 H5 和 H7 亚型双重实时荧光
RT-PCR 检测试剂盒使用说明书
用途 本试剂盒采用实时荧光 RT-PCR 方法检测禽组织、分泌物、排泄物及尿囊液中禽流感病毒 H5
（AIV-H5）和 H7 亚型（AIV-H7）的 RNA，适用于 AIV-H5、AIV-H7 的检测、诊断和流行病学调查。 原理 利用离心柱内硅基质膜提取样品总 RNA，在高效反转录酶的作用下，以 RNA 为模板，以引 物为起点合成与 RNA 模板互补的 cDNA 链。在热启动 Taq 酶的作用下，经高温变性、中温退火及 延伸的循环，使特异 DNA 片段的拷贝数放大一倍，经荧光素标记的探针与扩增的 DNA 杂交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，利用 荧光 PCR 仪检测特异性荧光信号，根据样品 Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。
试剂盒组成
保存期 本产品有效期为 12 个月。
需要自备的器材
1．仪器：分析天平、离心机、荧光 PCR 扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20
µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：荧光 PCR 专用反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5 mL 经焦碳酸二乙酯（DEPC）水 处理的灭菌离心管、吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）、灭菌双蒸水。
使用注意事项
1．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实验室。
2．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严 禁器材和试剂倒流。
3．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应完全融化，8000 rpm 离心 15 s， 使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立 即放回-20 ℃。
4．在 RNA 提取过程中，避免 RNA 酶污染，尽量缩短操作时间。
5．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
6．严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
7．反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。
8．反复冻融试剂将降低检测灵敏度，本试剂盒应在 3 次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。
RT-PCR 检测试剂盒使用说明书
用途 本试剂盒采用实时荧光 RT-PCR 方法检测禽组织、分泌物、排泄物及尿囊液中禽流感病毒 H5
（AIV-H5）和 H7 亚型（AIV-H7）的 RNA，适用于 AIV-H5、AIV-H7 的检测、诊断和流行病学调查。 原理 利用离心柱内硅基质膜提取样品总 RNA，在高效反转录酶的作用下，以 RNA 为模板，以引 物为起点合成与 RNA 模板互补的 cDNA 链。在热启动 Taq 酶的作用下，经高温变性、中温退火及 延伸的循环，使特异 DNA 片段的拷贝数放大一倍，经荧光素标记的探针与扩增的 DNA 杂交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，利用 荧光 PCR 仪检测特异性荧光信号，根据样品 Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。
试剂盒组成
| 名称 | 50 头份 | 贮藏条件 |
| 裂解液 | 30 mL | 室温（A 盒） |
| 洗液 | 60 mL | |
| 洗脱液 | 10 mL | |
| 吸附柱和收集管 | 50 套 | |
| 阴性对照 | 1 mL | -20 ℃（B 盒） |
| 阳性对照 | 600 µL | |
| 无菌无核酸酶水 | 600 µL | |
| RT-PCR 反应液 | 600 µL | |
| 酶混合液 | 25 µL | |
| 荧光探针 | 140 µL |
保存期 本产品有效期为 12 个月。
需要自备的器材
1．仪器：分析天平、离心机、荧光 PCR 扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20
µL、200 µL、1000 µL）。
2．耗材：荧光 PCR 专用反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5 mL 经焦碳酸二乙酯（DEPC）水 处理的灭菌离心管、吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）、灭菌双蒸水。
使用注意事项
1．所有接触病料的物品均应合理处置，以免污染实验室。
2．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严 禁器材和试剂倒流。
3．所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应完全融化，8000 rpm 离心 15 s， 使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立 即放回-20 ℃。
4．在 RNA 提取过程中，避免 RNA 酶污染，尽量缩短操作时间。
5．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
6．严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
7．反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。
8．反复冻融试剂将降低检测灵敏度，本试剂盒应在 3 次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。
样品制备
1 样品采集：病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理盐水中。2～8 ℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜， 严禁反复冻融。）
2 样品处理：每份样品分别处理。
2.1 组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约 1g，用手术剪剪碎混匀后取 0.02 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆后转至 1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 灭菌离心管中。
2.2 阳性对照处理：取阳性对照 100 µL，置 1.5 mL 灭菌离心管中。
2.3 阴性对照处理：取阴性对照 100 µL，置 1.5 mL 灭菌离心管中。
操作步骤
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液 600 µL，充分颠倒混匀，室温静置 3～
5 min。
1.2 将液体吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时 堵塞吸附柱），13000 rpm 离心 30 s。
1.3 弃去收集管中液体，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 离心 30 s。
1.4 重复步骤 1.3。
1.5 弃去收集管中液体，13000 rpm 空柱离心 2 min，以除去残留的洗涤液。
1.6 将吸附柱移入新的 1.5 mL 离心管中，向柱中央加入洗脱液 50 µL，室温静置 1 min，13000 rpm
离心 30 s，离心管中液体即为模板 RNA。
2 实时荧光 RT-PCR 操作
设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为 N，每份总体积 20µL，反应体系配制如下：| 试剂 | 体系 |
| 无菌无核酸酶水 | 2.3（N+1）µL |
| RT-PCR 反应液 | 10（N+1）µL |
| 酶混合液 | 0.4（N+1）µL |
| 荧光探针 | 2.3（N+1）µL |
将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各 15 µL。分别取 5 µL 模板 RNA，加入相应反应管中，混匀并作好标记，其中 AIV-H7 荧光报告基团为 FAM，AIV-H5 为 HEX，淬灭基团均为 None（如果仪器没有 HEX 校正过，可暂时用 VIC 代替）。在 荧光 PCR 仪上进行以下反应：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每个循环第二步
（60℃ 35s）收集荧光信号，共 40 个循环。
结果判定
1 结果分析条件设定 阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音
情况进行调整。
2 结果描述及判定
阳性对照 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线，阴性对照无 Ct 值并且无特定扩增曲线，实验结 果成立；被检样品若 FAM 荧光信号 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线为 H7 阳性；被检样品若 Hex 荧光信号 Ct 值≤30 并出现特定的扩增曲线为 H5 阳性；被检样品 30＜Ct＜35 并出现特定的扩增曲线， 需重新取样提取 RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品 Ct 值≥35 时， 超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现 S 型曲线，但本底较高的样品，应为阴 性。
试剂盒售后：本公司出售的试剂盒均保质保量，质量问题均可免费退换，另提供免费代测服务。
细胞售后：
1. 细胞运输丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；
3. 细胞收到当天以及第2,3天请拍照，未告知的视为产品合格。4-10天内出现问题，请提供细胞照片和细胞出现问题的照片以及细胞相关操作的详细步骤，并跟我公司人员及时沟通判定是否重发，具体可以参照我官网或者随货说明书相关售后条款。
细胞售后：
1. 细胞运输丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；
3. 细胞收到当天以及第2,3天请拍照，未告知的视为产品合格。4-10天内出现问题，请提供细胞照片和细胞出现问题的照片以及细胞相关操作的详细步骤，并跟我公司人员及时沟通判定是否重发，具体可以参照我官网或者随货说明书相关售后条款。
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