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RNA提取：
细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。
RNA提取的使用目的:
通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA，可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析， DNA文库构建，基因克隆等实验。RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。
cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；
Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；
RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因此，明确实验目的是进行后续实验的首要条件。
RNA提取的方法
RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入lvfang离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后，RNA通过yi bing chun沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入yi bing chun沉淀可从有机相得到蛋白质。
RNA提取实验操作步骤
准备试剂：
lvfang，yibingchun,75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。
操作步骤：
细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。
RNA提取的使用目的:
通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA，可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析， DNA文库构建，基因克隆等实验。RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。
cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；
Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；
RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因此，明确实验目的是进行后续实验的首要条件。
RNA提取的方法
RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入lvfang离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后，RNA通过yi bing chun沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入yi bing chun沉淀可从有机相得到蛋白质。
RNA提取实验操作步骤
准备试剂：
lvfang，yibingchun,75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。
操作步骤：
- 匀浆处理
- 植物组织:
- 以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.
-
- 动物组织:
- 以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.
-
- 单层培养细胞.
- 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.
注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染. -
- 细胞悬液:
- 离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
-
- 血液处理:
- 直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
- 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。
- 可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min，取上清。
- 如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
- 每使用1ml Trizol加0.2ml（lvfang)，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。
- 4 ℃ 10 000rpm离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）
- 在得到的水相溶液中加入等体积的yi bing chun，混匀，-20℃ 放置20-30min。
- 植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的yi bing chun，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。
- 4 ℃ 10 000rpm离心10min，去上清。
- 离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
- 加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
- 4 ℃ 10 000rpm离心2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。
- 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。
RNA提取的注意事项:
- 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ：加800ul Trizol，样品裂解后加lvfang，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。
- 匀浆后，加试剂前，样品可在-70 ℃放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70 ℃长期保存。MDL承接种类齐全的实验
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