RCA扩增试剂盒

特别提示：包括RCA扩增试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：RCA扩增试剂盒
英文名称：Rolling Circle Amplification Kit
产品货号：MT0135
产品规格：100T

本试剂盒基于滚环扩增技术，配备的phi29 DNA聚合酶具有链置换和连续合成特性，可连续合成长达70kb的DNA片段。另外，该酶具有3’→5’外切酶校读功能，合成的DNA片段保真性高。试剂盒配备的Random Hexamers为6碱基随机引物可对目标分子进行指数放大（通常放大10000倍）。

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是近几年发展起来的一种核酸恒温扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在phi29 DNA聚合酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。因其高灵敏度、高特异性和可操作性，RCA技术在基础研究、实际检测、医疗诊断及纳米材料等方面都有很好的应用，结合细胞原位检测、单核苷酸多态性SNPs，蛋白质分析、免疫芯片和全基因组的扩增等研究都能发挥其巨大的优势。



试剂盒特点：
高灵敏度：单引物RCA的扩增效率成指数扩大，可达10⁴～10⁵。
操作简单：恒温扩增，程序简单化。
仪器简单：只需维持恒温的水浴锅。
应用广泛：可广泛应用于基础研究和医疗诊断等领域。

试剂盒组成：
 

组分	规格
phi29 DNA Polymerase (20U/μl)	50μl
10×phi29 Buffer	1ml
Yeast Pyrophosphatase (0.1U/μl)	25μl
10mM dNTP Mixture	200μl
25×Random Hexamer	100μl

储存：-20℃可保存3年，避免反复冻融。

应用实例：

应用本试剂盒以pEasy质粒为模板，30℃作用5h。泳道1-5是模板浓度分别为0.0004，0.004，0.04，0.4，1ng/μl，泳道6-10分别为泳道1-5相对应的RCA产物用PstI酶切后的产物，M为D10000 DNA Marker。


应用本试剂盒以人基因组为模板，30℃作用5h。泳道1-6是模板浓度分别为0.0004，0.002，0.004，0.04，0.4，1ng/μl，M为D10000 DNA Marker。

使用方法：
1．按以下组分配置反应混合液
 

成分	用量
10×phi29 Buffer	2.5μl
10mM dNTP Mixture	2μl
25×Random Hexamers	1μl
模板DNA	0.01-20ng
ddH2O	up to 25μl

2．变性退火，将上述产物置于PCR上，93℃变性3min，25℃ 5min。
3．向上述退火产物中加入0.5μl phi29 DNA Polymerase和0.2μl Yeast Pyrophosphatase，混合均匀后放置到30℃反应2～16h（根据所需的产物量进行反应时间调整，通常分别在2h、5h、16h进行电泳确认）。
4．反应结束后65℃ 10min进行失活反应。

注意事项：
RCA扩增还可应用于其它缺刻或诊断相应的实验，此时Random Hexamer为非必须品。

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产品特点：
1. 简便、快捷完成miRNA的检测。
2. 检测通量高，只需最少的RNA样本，即可同时进行多种目标miRNA的检测。
3. 检测特异性好，独特的miRNA引物设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-miRNA的污染。
4. 检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的miRNA。
5. 检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA。

试剂盒组成：
 

成分	规格
2×miRNA qPCR Mix	0.75ml
Reverse Primer(10μm)	30μl
RNase-Free Water	1ml
miRNA cDNA第一链合成试剂盒	25T
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、miRNA cDNA第一链合成
请参见miRNA cDNA 第一链合成试剂盒产品使用说明书。

二、miRNA荧光定量检测
1.室温融化2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer(10μm)。
2. 使用时请将2×miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经短暂离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。
3. 按照下表组分配制荧光定量PCR反应体系：
 

试剂组份	体积
2×miRNA qPCR Mix	25μl
Forward Primer(自备)	1μl
Reverse Primer	1μl
miRNA 第一链cDNA	xμl
RNase-Free Water	至50μl

4. 建议反应程序设置如下：
 

循环	温度	时间
1×	95℃	10min
40～45×	95℃	15s
	60℃	1min
溶解曲线分析	根据PCR仪要求设定

注意事项：
1. miRNA 第一链cDNA的加入量不要超过Real time PCR 体积10%。
2. 对于特殊的检测体系，高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA(稀释10倍或者100倍)。
3. 2×miRNA qPCR Mix中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

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