植物RNA提取试剂盒

特别提示：包括植物RNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：植物RNA提取试剂盒
英文名称：RNApure Plant Kit
产品货号：WE0408
产品规格：50T

本试剂盒用于从各种植物中提取纯化高品质总RNA，也适用于真菌菌丝RNA的提取。独特的Shredder分离柱，用于匀质化和过滤高粘度的植物或真菌裂解物，同时采用硅基质膜吸附RNA进行纯化，使多聚糖等各种污染物通过洗涤被有效去除，经洗脱的RNA可直接用于各种下游实验。由本试剂盒提取RNA分子量大于200碱基，纯度高，几乎无DNA残留。如果是对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase I在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot、Dot Blot、RT-PCR和体外翻译等实验。
试剂盒组成：
 

组份	50次
Buffer RL	35mL
Buffer RLC	35mL
Buffer RW1	40mL
Buffer RW2(浓缩液)	11mL
RNase-Free Water	10mL
吸附柱FL及收集管	50套
吸附柱RM及收集管	50套
无RNA酶离心管(1.5mL)	50个

保存条件：RT

自备试剂：
β-巯基乙醇、无水乙醇(新开封或提取RNA专用)。
实验前准备及重要注意事项：
1、预防RNase污染，应注意以下几方面：
1)使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2)玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
3)配制溶液应使用无RNase的水。
4)操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。
3、Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为1%。如1ml Buffer RL加10μL β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。Buffer RLC使用时不需加β-巯基乙醇。
4、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5、Buffer RL和Buffer RLC如果产生沉淀，请加热使其溶解后室温放置。
6、所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。
7、若下游实验对DNA非常敏感，建议用不含RNase的DNase I(货号：WE0213)对RNA进行处理。
操作步骤：
1、取植物新鲜组织50-100mg，加入液氮迅速研磨成粉末。
2、将研磨后的粉末收集到离心管(自备)中，加入600μL Buffer RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇)或Buffer RLC，涡旋振荡使其充分裂解。
【注】：
● Buffer RL主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解。但有些植物组织(如玉米的胚乳)，由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生沉淀，导致RNA提取效果不佳，此时可加入Buffer RLC替代Buffer RL。
● 56℃孵育1-3分钟有助于组织的裂解，但是淀粉含量高的植物不要进行高温孵育。
3、将步骤2所得全部液体转移至已装入收集管的吸附柱FL中,12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将收集管中的上清液转移到一个新的离心管(自备)中。
【注】：
● 在吸取液体时可以将枪头尖端剪掉，便于取样。
● 吸附柱FL可以除去大部分的碎片，但仍会有小部分流出，离心后会在收集管内形成沉淀，在进行下一步时注意避免吸到沉淀。
4、在步骤3所得干净的裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀。
【注】：
● 加入乙醇后可能会产生沉淀，但不影响后续试验。
5、将步骤4得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱RM中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入。12,000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入700μL Buffer RW1,12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
可选步骤：如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，则用以下步骤替代步骤6。
1)向吸附柱中加入350μL Buffer RW1,12,000rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2)配制DNase I混合液：取52μL RNase-Free Water，向其中加入8μL 10×Reaction Buffer和20μL DNase I(1U/μL)，混匀，配制成终体积为80μL的反应液。
【注】：
● 以上体系为按照我公司产品DNase I(WE0213)反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。
3)向吸附柱中直接加入80μL DNase I反应液,20-30℃孵育15分钟。
4)向吸附柱中加入350μL Buffer RW1,12,000rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μL Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇),12,000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8、重复步骤7。
9、12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。
【注】：
● 这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
10、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入30-50μL RNase-Free Water，室温放置1分钟,12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液,-70℃保存RNA，防止降解。
【注】：
● RNase-Free Water体积不应小于30μL，体积过小影响回收率。
● 如果要提高RNA的产量，可用30-50μL新的RNase-Free Water重复步骤10。
● 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤10。

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货号	名称	规格
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名称：柱式病毒RNA提取试剂盒
货号：BTN71001
规格：50次
本试剂盒是在一管式病毒RNA提取试剂盒的基础上开发的，适用于从血清、血浆、脑脊液、尿液、粪便、培养细胞上清液、口腔拭子、咽喉拭子等样品中提取微量病毒RNA的产品。

试剂盒特点：
1．操作简单，整个过程只需要20分钟左右，不需要额外在洗柱液中补加乙醇。
2．灵敏度高，通过RT-PCR检测到的最终灵敏度可以达到50拷贝/mL。
3．安全无毒，不需要使用苯酚和lǜ仿等有机溶液。
4．如果加上病毒离心富集步骤，最多可以处理1.5mL液体病毒样品。
5．与RT-PCR和荧光RT-PCR兼容。
6．价廉物美，性价比远低于国外同类产品。

试剂盒组成：
 

组分	规格
RNA病毒裂解液	30ml
上柱结合液	40ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
RNA洗脱液	10ml
说明书	1份

保存条件：RT，有效期一年，其中RNA病毒裂解液需4℃保存。

使用方法：
1．如果有N个样品，标记N+2个1.5～2mL螺旋盖塑料离心管，多出的一个为阳性对照，一个为阴性对照。为避免污染，建议不要使用压盖式塑料离心管。在每个管上做个标记，以在后续操作时区别向心面和离心面。然后各加入0.2mL液体样品(血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液、眼泪等等)。不同样品处理方法如下：

① 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各种拭子样品，则将拭子放入0.2mL自备生理盐水中挤压出液体，然后取0.2mL进行提取。
② 如果是粪便等半固定样品，则取约0.3mL的样品，加入0.3mL自备生理盐水，震荡重悬，离心取0.2mL上清进行提取。
③ 如果血液，细胞培养液等含细胞的液体，可以离心用上清，也可以直接取用，但后者提取的RNA中有细胞的基因组DNA污染。血浆的抗凝剂必须是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD时由于所加入ACD会增加体积，样品会被稀释，得到的病毒滴度会比使用EDTA低15%左右。血浆最好按0.6mL/管的量分装保存，以避免反复冻融。
④ 如果样品是实体组织或培养细胞，则需要在自备生理盐水中匀浆后离心，用0.2mL上清液(含病毒)进行提取，但此种情况下最后得到的RNA不可避免的会含有基因组DNA污染。
⑤ 如果液体样品中的病毒需要富集，可以使用1.5mL上述方法得到的液体在4℃条件下24,000g冷冻离心60分钟，移弃1.3mL、用剩下的0.2mL继续操作。

2．加入0.6mL RNA病毒裂解液，振荡30秒混匀后室温放置10分钟。
  注意：RNA病毒裂解液在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3．加入0.8mL上柱结合液到离心管中，颠倒混匀后转移一半的混合液(0.8mL)到离心吸附柱中，室温放置2分钟。
4．12,000rpm室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。
5．将剩余的另外一半裂解液(0.8mL)转移到离心吸附柱中，室温放置2分钟。
6．12,000rpm室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。
7．加入0.7mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000rmp室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。
8．加入0.3mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000rmp室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。此为第二次洗涤，可以跳过。
9．12000g室温离心半分钟。
10．在离心吸附柱的滤膜的中部加入30-100μL RNA洗脱液，然后将离心吸附柱套入一新的1.5mL离心管中，室温放置2分钟。
11．12000g室温离心1分钟，离心管中收集的样品即为RNA。
12．RNA样品可以直接用于RT-PCR或逆转录反应，也可放-80℃长期保存。

疑难解答：
提取液体样品/病毒核酸(RNA或DNA)为何很难？
原因一是量少。病毒颗粒中的RNA或DNA是作为遗传物质保存，每个病毒最多只携带几个拷贝(而一个细胞中有上万种RNA分子，每种RNA有很多拷贝)，同时其长度也十分有限(一般不到细胞基因组的万分之一)，样品中病毒数往往又不是很多，使得样品中病毒核酸的绝对量往往比一个细胞中核酸的绝对量还少，所以操作中十分容易丢失。另外，由于得到的核酸绝对量很少，不能使用电泳和测OD检测，只能通过PCR或RT-PCR检测，而PCR或RT-PCR的条件又需要优化，所以要确定提取是否成功十分不容易。

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