LP293转染试剂

特别提示：包括LP293转染试剂在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：LP293转染试剂
英文名称：LP293 Transfection Reagent
产品货号：YTB3201
产品规格：0.5mL|1.5mL|5×1.5mL

本制品是一种主要用于贴壁生长的HEK293、HEK293T、HEK293A、293FT等293系列细胞的基于新型阳离子脂质体的转染试剂。

LP293转染试剂对HEK293细胞系列的转染效率约70%以上，同时其具有细胞毒性低、重复性好、操作简单、转染后无需更换培养基以及成本低等突出优点。

LP293转染试剂也能用于其它贴壁细胞的转染，但转染效率远低于我公司的LP6000转染试剂(YT916)和LP8000转染试剂(YTB3200)。因此不太推荐使用LP293转染试剂用于293系列之外的细胞转染，仅当用于荧光素酶报告基因等检测灵敏度特别高的实验，并且用于一些比较容易转染的细胞时，才可以考虑使用LP293转染试剂。

LP293转染试剂转染时血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少避免很多阳离子脂质体因为需要在转染时去除血清而对细胞造成的损伤。

LP293转染试剂转染质粒进入贴壁培养的HEK293等293系列细胞后，通常在24-48小时后达到比较理想的蛋白表达水平。

LP293转染试剂的转染效率可以通过转染表达EGFP或其它荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。

LP293转染试剂的转染效果请参考图1。

图1.LP293转染试剂转染的转染效果图。LP293转染试剂转染EGFP表达质粒至HEK293 (A,B)、HEK293T (C,D)和293FT (E,F)细胞的效果图。其中A、C、E为荧光照片；B、D、F为相应的明场照片。

每毫升LP293转染试剂大约可以转染10厘米培养皿33个、6厘米培养皿100个、6孔板200个孔、12孔板500个孔、24孔板1000个孔、48孔板2000个孔、96孔板5000个孔。

注意事项：
 

• 使用高纯度的DNA有助于获得较高的转染效率。对于质粒，可以使用我公司的质粒大量抽提试剂盒(YT003)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。
• 转染前细胞必须处于良好的生长状态。
• 对于非293系列细胞，推荐使用我公司的LP6000转染试剂(YT916)或LP8000转染试剂(YTB3200)。对于悬浮培养的293系列细胞，推荐使用我公司的LP293S转染试剂(YTB3202)。
• 需自备不含抗生素的无血清培养液或Opti-MEM Medium。
• LP293转染试剂不能vortex或离心，可以用移液器轻轻吹打混匀或缓慢摇动混匀。
• LP293转染试剂使用后请立即盖好盖子，避免长时间暴露在空气中，影响转染效率。
• 本产品对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

 

• 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)把约20-60万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度而定)培养到六孔板内，使第二天细胞能达到约60-70%。
• 在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清，不含抗生素)。可以使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素的存在对于有些细胞容易导致转染后出现一定的细胞毒性。
• 参考下表，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌离心管，分别加入125μl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM Medium，然后于其中一管加入2.5μg质粒DNA，并用枪轻轻吹打混匀；另一管加入5μl LP293转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。将含有DNA的培养液用枪轻轻加入含LP293转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置15分钟(室温存放6小时内稳定)。
   

  	96-well	48-well	24-well	12-well	>6-well	6cm dish	10cm dish
  LP293转染试剂	0.2μl	0.5μl	1μl	2μl	>5μl	10μl	30μl
  无血清培养液或Opti-MEM Medium	5μl	12.5μl	25μl	50μl	>125μl	250μl	750μl
  DNA	100ng	250ng	500ng	1μg	>2.5μg	5μg	15μg
  无血清培养液或Opti-MEM Medium	5μl	12.5μl	25μl	50μl	>125μl	250μl	750μl
  单独稀释好的LP293转染试剂和DNA，混匀并室温静止放置15分钟
  每孔加入的混合物的量	10μl	25μl	50μl	100μl	>250μl	500μl	1500μl
  按照上述用量每孔均匀滴加LP293细胞转染试剂和DNA的混合物，继续培养48-72小时

  
  注意：
   
  • 对于六孔板中一个孔的细胞，LP293转染试剂的用量可以在3-12.5μl内进行适当调节，DNA用量可以在1-4μg的范围内进行适当调节。质粒用量(μg)和LP293(μl)的用量1:2比较常用。最佳的转染条件，因不同细胞类型和培养条件而定，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
  • 对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况，可以把每个孔所需的LP293转染试剂和DNA混合物分别配制，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀并孵育20分钟后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。
  • 对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养面积按比例进行换算。如果转染RNA或寡核苷酸等可以参考转染DNA的条件进行。
• 按照六孔板每孔250μl LP293转染试剂-DNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。
• 继续培养约24-48小时后，即可用适当方式检测转染效果，例如荧光检测、Western、ELISA、报告基因等，或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。

常见问题：

 

• 转染效率低：
   
  • 优化质粒与LP293转染试剂比例，适当加大质粒用量。
  • 应使用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A260/A280比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用我公司的质粒大量抽提试剂盒(YT003)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。
  • 需用无抗生素和无血清培养液配制LP293转染试剂和质粒的混合物。
  • 细胞转染时应状态良好，并且使用本产品时细胞密度达到60-70%时最适合进行转染，过稀或过密都可能影响转染效率，不同细胞的最佳转染密度需要自行摸索。
  • 转染后培养时间不足，而被误认为转染效率偏低。细胞转染后至显著表达所需培养时间通常为24-48小时。
  • 检查细胞是否支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。
  • 如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框完全正确。启动子、复制起始位点、质粒大小都会影响基因表达水平。
• 出现一定的细胞毒性：
   
  • 转染前，细胞至少铺板18-24小时。
  • 目的基因的表达蛋白有毒性。此时可以和空载质粒转染效果比较，以确定是否是目的基因蛋白表达对细胞产生毒性。如果确定有细胞毒性，可以考虑适当减少质粒用量，并按照比例减少LP293转染试剂。
  • 检查是否转染时细胞密度太低。
  • 检查细胞是否有支原体等微生物污染。

附录：
常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表：
 

Multiple Well Plates or Dishes	Single Well Only for Plates
	Diameter (Bottom,mm)*	Growth Area (cm2)*	Average Cell Yield	Total Well Volume (ml)	Working Volume (ml)	Recommended Volume (ml)
6 well	34.8	9.5	9.5×105	16.8	1.9-2.9	2
12 well	22.1	3.8	3.8×105	6.9	0.76-1.14	1
24 well	15.6	1.9	1.9×105	3.4	0.38-0.57	0.5
48 well	11.0	0.95	9.5×104	1.6	0.19-0.285	0.25
96 well	6.4	0.32	3.2×104	0.36	0.10-0.20	0.1
384 well	2.7	0.056	5.6×103	0.112	0.025-0.050	0.030
1536 well	1.63×1.63**	0.025	2.5×103	0.0125	0.005-0.010	0.010
3.5cm dish	34	9	9.0×105	NA	1.8-2.7	2
6cm dish	52	21	2.1×106	NA	4.2-6.3	5
10cm dish	8.4	55	5.5×106	NA	11-16.5	12
15cm dish	14	152	1.5×107	NA	30.4-45.6	35
24.5cm dish	22.4×22.4**	500	5.0×107	NA	100-150	120

*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer,and the listed sizes are from Corning.
**These wells or dishes are square.

根据您的关注的LP293转染试剂，贴壁HEK293A细胞转染试剂，贴壁HEK293细胞转染试剂，贴壁HEK293T细胞转染试剂，贴壁293FT细胞转染试剂，您可能还对以下产品有需求：



名称：Oligo快速复性液
货号：BTN130204
规格：1mL
本产品是精心优化的、专门用于Oligo快速复性的试剂，广泛用于以单链Oligo为材料制备Adaptor、Linker和其他双链Oligo分子，跟各种后续的分子生物学实验兼容，包括文库构建、抑制性差减杂交、AFLP等。本产品即可用于DNA-DNA Oligo复性，也适用于RNA-RNA Oligo和DNA-RNAOligo复性。还适用于带修饰碱基的Oligo的复性。

储存条件：低温运输、-20℃避光保存、有效期一年。

名称：一站式TA克隆试剂盒(含感受态细胞)
货号：BTN90801B
规格：20次
TA克隆就是利用T载体两个3′端各带有一个T突出，而PCR扩增产物两个3′端各带有一个A突出的特点，在DNA连接酶的作用下，将PCR产物克隆到T载体中的过程，它是克隆PCR扩增产物的主要手段。

产品特点：
1.一站式，用户只需要准备PCR产物即可进行TA克隆。
2. T载体由Xcm I酶切方法制备，两个5′端100%含T突出，自连率几乎为零。
3. 克隆效率高，一次TA克隆实验一般能得到上百个重组子。
4. 阳性率高，一般能到90%以上，大大缩短了筛选工作。
5. 提供供两次实验用的对照插入片段，方便分析实验数据。
6. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点(如EcoR I)，便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。
7. 克隆位点两侧分别有T3和T7 RNA聚合酶启动子，便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
8.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
9. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。
10.含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可以制备单链DNA。

 

成分	规格
即用型蓝白T载体(50ng/μL)	20μl
对照插入片段(50ng/μL)	5μl
T4快速连接缓冲液，2×	100μl
T4 DNA连接酶(5U/μL)	30μl
超纯水	1ml
高效感受态细胞	100μL×10只(只B型有)
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。感受态细胞需要干冰运输，-70℃保存，有效期6个月。

自备试剂：插入片段。

使用方法：

一：PCR产物的纯化和定量注意事项
1. 由于PCR体系中有大量会抑制DNA连接反应的dATP、还有一些可能在电泳胶上不一定会显示出来的非特异性扩增产物和引物二聚体，所以PCR产物必须用胶回收方法制备才能用于本试剂盒的连接。可以分别使用本公司柱式DNArc(BTN60202)和PAGE DNArc(包括柱式PAGE DNArc)从琼脂糖胶和PAGE胶上纯化回收PCR片段。具体操作见相关产品使用手册。
2. 琼脂糖胶回收的电泳缓冲液最好不要使用TBE缓冲液，因为它会影响DNA的胶回收效率。
3. 为避免UV对DNA的伤害，切胶最好在日光下进行(使用百奥莱博的绿如蓝染料的话，可以直接在黑色背景下看见DNA条带，不需要紫外光)。如果使用EB或其他染料，必须在紫外下切胶时，最好选择长波(360nm)紫外灯并以最快速度切胶，文献报道短波UV(300nm和240nm)会使DNA连接效率降低400多倍。使用短波UV时，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)减少伤害。
4. PCR片段的体积越小越便于后续操作。洗脱PCR片段时，用最少量的洗脱液洗脱。
 本试剂盒要求PCR回收片段的浓度最好为50ng/μL。如果浓度不够，最好用醇沉淀法沉淀后直接在管内设置连接反应，也可以使用本公司的核酸浓缩剂(BTN110801)直接浓缩。
5. 为准确定量回收的PCR产物同时又节约样品，最好使用微量分光光度计(只需用1μL样品测量)。如果分光光度计需要大量样品，建议使用电泳法定量：将回收的PCR片段与浓度已知的DNA Marker在含EB或绿如蓝染料的琼脂糖凝胶中电泳，通过比较DNA条带的相对荧光强度而估测PCR产物的浓度。

二：连接反应
1. 短暂离心装有蓝白T载体、连接缓冲液和T4连接酶的离心管。
2.在三个离心管中加入下列成分(注意，对照可以不做，在出现问题时再做)：
 

成份	样品管	阳性对照管	自连对照管
T4快速连接缓冲液，2×	5μl	5μl	5μl
蓝白T载体(50 ng/μL)(=0.03 pmol/μL)	1μl	1μl	1μl
自备PCR 纯化产物(0.03-0.1 pmol/μL)	Xμl(见注)	不加	不加
对照插入片段(50ng/μL)(=0.06 pmol/μL)	不加	1.5μl	不加
T4 DNA连接酶(5U/μL)	1-1.5μL	1-1.5μL	1-1.5μL
超纯水	补到10μL	补到10μL	补到10μL

注: 如何根据T载体的用量计算PCR纯化片段的最佳用量？
第一：确定插入片段与载体的最佳摩尔比，在本产品的T载体的长度固定(3Kb)时，最佳摩尔比跟插入片段的长度关系如下：
 

插入片段长度	与载体的摩尔比
1Kb以下	2:1或3:1
跟T载体接近(±1Kb)	1:1
比T载体长1Kb或更多	1:2或1:3

第二：根据选定的最佳摩尔比按下面方程式计算用量：

本产品提供的T载体长度为3 Kb，推荐用量为50ng，如果PCR片段长度为0.5 Kb，最佳摩尔比设定为3:1，则其用量为:

3. 用移液器吹打连接反应液使之混匀，然后放置在16℃孵育30分钟-过夜。
4. 65℃5分钟灭活连接酶后直接用于转化或-20℃保存。

三：细菌转化及筛选(仅供参考，本产品不提供相关试剂)
1. 将100μl转化效率在1×108 cfu/μg以上的感受态细胞于冰上解冻。
2. 取5-10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。
3.在冰上放置30分钟。
4. 将离心管放42℃热休克90秒，然后快速将其转移到冰浴中放置1～2分钟。
5. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时复苏细胞。
6. 将100μL复苏涂布到含Amp的LB琼脂平板上(也可加上X-gal和IPTG)。
7.室温4,000rpm离心剩余的900μl复苏细胞5分钟，弃去800μl上清，用剩余100μL培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。
8. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要，否则培养板将在37℃排除水分，细菌将随水在培养基上到处游动，不能形成单个菌落。
9. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组总共会有上千个菌落(100μl转化液产生的菌落数×10)，自联对照只有少数几个菌落，样品组的菌落数取决于PCR回收片段的质量。
10. 按常规方法筛选重组子。

MCS位点：


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货号	名称	规格
BTN130511	大肠杆菌JM110化学感受态细胞	10*100μl
YT413	溶菌酶(>20KU/mg)	0.5g
YT445	AP1荧光素酶报告基因质粒	1μg
SY0286	多片段一步法快速克隆试剂盒	10T|5×10T
JN0102	Easy Digestion T载体(pED-T)	20次
MQ0009	XL2-Blue化学感受态细胞	10×100μl|50×100μl
GS0129	Top10感受态细胞	10×100μl|20×100μl

北京百奥莱博科技有限公司一家专注于生命科学研究领域的生物技术公司，坚持“质量至上，服务为本，全心全意助力生命科学”的理念，为广大用于提供稳定、可靠、专业的产品和服务支持，产品线包括分子生物学，细胞生物学，免疫检测，抗体，重组蛋白，血液制品等系列。“忙忙碌碌的平凡，铸就事业的不凡”。让我们携起手来，共同创造生命科学的蓬勃发展。