柱式动物RNA提取试剂盒

特别提示：包括柱式动物RNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：柱式动物RNA提取试剂盒
英文名称：RNasy Animal RNA Isolation Kit with Spin Column
产品货号：YTB4004
产品规格：12次|50次|200次

本试剂盒是一种基于离心柱法从动物组织或培养的动物细胞中安全、快速、便捷、稳定、高效、高质量地抽提长度大于200个核苷酸(nucleotide,nt)的RNA的试剂盒。抽提获得的大于200个核苷酸的RNA(也常被称为总RNA)可以用于各种常规用途。

本试剂盒抽提得到的RNA可用于反转录、RT-PCR、qPCR、Northern、点杂交、纯化mRNA、体外翻译、RNase protection assay、cDNA克隆等下游实验；也可用于基因表达芯片分析、高通量测序等对RNA质量要求较高的情况。

三款离心柱式及Trizol法RNA抽提试剂盒的主要特点和差异如下：
 

货号	YTB4004	YTB4005	YTB4006	YT526/YT527
产品名称	RNasy动物RNA 提取试剂盒	RNasy动物小RNA 提取试剂盒	RNasy II动物RNA 提取试剂盒	总RNA抽提试剂(Trizol法)
推荐指数	★★★★★	★★★★★	★★★	★★
抽提方式	离心柱式	离心柱式	离心柱式	原始方式
抽提产物	RNA(＞200nt)	小RNA(＜200nt)	总RNA(含＜200nt的小RNA)	总RNA(含＜200nt的小RNA)
操作时间	最短(15-20分钟)	稍较长(20-25分钟)	较长(25-30分钟)	最长(45-60分钟)
使用便捷性	★★★★★	★★★★	★★★★	★★
推荐细胞量/得率	50-100万/5-20μg	50万/1-2μg	50-100万/5-20μg	50-100万/5-20μg
推荐组织量/得率	5-20mg/10-40μg (多)	5mg/1-1.5μg (少)	3-5mg/3-10μg (少)	50mg/100-500μg (很多)
RNA纯度	高	高	高	高
有毒有害试剂	无	无	无	有
人体与环境安全	高	高	高	低
用途	非小RNA相关各种用途	小RNA相关各种用途	不同长度RNA各种用途	不同长度RNA各种用途

动物组织或细胞中的RNA按照长度可以分为长链RNA和小RNA，长链RNA通常大于200nt，而小RNA通常小于200nt。长链RNA按照是否编码蛋白或多肽可以分为长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非编码的5.8S rRNA、5S rRNA、tRNA、microRNA、siRNA、piRNA、tsRNA、srRNA等。

本试剂盒抽提RNA的基本流程如图1所示。样品在裂解液中迅速裂解，释放出总RNA，然后让RNA特异性地结合到纯化柱上，而基因组DNA和蛋白质等其它组分通过高速离心被有效去除，再通过3次洗涤充分去除非特异性结合的蛋白、盐等杂质，最后用洗脱液将高纯度的RNA洗脱下来。



试剂盒特点：
 

• 本试剂盒使用安全。本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行RNA分离纯化，能有效避免传统的Trizol法抽提时使用的酚、氯fǎng等有毒有害有机试剂。
• 本试剂盒使用快速、便捷。本试剂盒采用柱纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，抽提操作过程仅15-20分钟。相比于传统的Trizol抽提法，本试剂盒的操作流程显著简化，缩短了抽提时间，降低了RNA被降解的风险。和国外同类柱纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。
• 本试剂盒抽提RNA的得率高，优于国外同类产品。本试剂盒的抽提效果经反复测试，100万个HeLa细胞能抽提得到约15-20μgRNA，20mg小鼠肝组织能抽提得到约25-35μgRNA，20mg小鼠脑组织中抽提得到约10-20μgRNA(新鲜样品的得率高于冻存样品)。
• 本试剂盒抽提得到的RNA纯度高，显著优于Trizol和国外Q品牌的同类产品。本试剂盒抽提得到的RNA的A260/A280通常为2.0-2.2。A260/A230通常为1.9-2.1。
  注：纯的RNA其A260/A280约为2.0，但在很多仪器上测定时会高于2.0，低于1.9通常认为有蛋白、DNA或者酚等的污染；纯的RNA其A260/A230约为2.0左右或者略高，低于1.9通常认为有碳水化合物、胍盐、多肽或酚等的污染。

本试剂盒适用于新鲜或冻存的动物组织或细胞RNA的抽提，推荐的细胞用量为50-100万(上限可达1000万)，组织用量为15-20mg(上限可达30mg)。对于不同的组织或细胞上限会有所差别，例如小鼠肝脏组织的上限可达30mg，但肌肉组织的上限为20mg。

试剂盒组成：
 

组分	12次	50次	200次
裂解液	8ml	32ml	125ml
结合液	8ml	32ml	125ml
洗涤液I	8ml	32ml	125ml
洗涤液II	15ml	63ml	125ml×2
洗脱液	1.2ml	5ml	15ml
RNA纯化柱及废液收集管	12套	50套	200套
RNA洗脱管	12个	50个	200个
说明书	1份	1份	1份

保存条件：室温保存，一年有效。

注意事项：
 

• 对于富含RNase的样品(如动物组织)，建议使用前在裂解液中添加二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)至终浓度为40mM (例如1ml裂解液中加入20μl 2M DTT)或β-巯基乙醇至终浓度为1% (如1ml裂解液中加入10μl β-巯基乙醇)。含DTT或β-巯基乙醇的裂解液可在室温放置1个月。
• 通过本试剂盒抽提到的RNA已经去除绝大多数DNA，通常情况无需DNase处理。后续如进行某些对极少量DNA残留较敏感的实验时，可以在使用说明中步骤4离心后，在纯化柱中加入适量DNase I (如80μl含10U DNase I的酶溶液，推荐使用我公司的DNase I，货号：YT411)，室温消化15分钟。消化结束后，不要离心，直接加入500μl洗涤液II，进入使用说明的步骤5进行操作。
• 本试剂盒提供的所有试剂和耗材都是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。
• 对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用我公司的核酸酶清除剂(YT400)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
• 使用冻存的细胞或组织抽提RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并剪切样品中的RNA。对于组织样品，推荐使用我公司的动物组织RNA稳定保存液（货号：YTB4010）进行保存以保证样品RNA的完整性。
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
• 废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
• 结合液、洗涤液中含有乙醇，使用后须旋紧瓶盖以防挥发，并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。

使用说明：
 

• 样品的准备。
   
  • 细胞样品：收集50-100万左右的细胞。对于悬浮细胞，1000-2000g离心1分钟后弃上清，加入300μl裂解液，轻轻吹打8-10次至固悬物溶解、溶液澄清；对于贴壁细胞，吸净培养液后加入300μl裂解液，轻轻吹打5-10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至一洁净离心管内。
  • 组织样品：取15-20mg动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600μl裂解液。也可将组织置于1.5ml离心管中，迅速加入600μl冰浴预冷的裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8-10次，室温放置3-5分钟。然后约14,000g离心2分钟，将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
  
  注意：细胞的数量一般不超过500万，不超过100万细胞宜使用300μl裂解液，多于100万细胞宜使用600μl裂解液。动物组织的用量一般不超过30mg，用量过多可能会因裂解不充分导致得率下降。组织样品在裂解和离心后，离心管下部可能会有一些胶状物质，宜作为上清转移至下一步操作。如果弃除胶状物，会导致得率下降约30-50%。后续加入结合液后胶状物会消失。离心是为了去除未匀浆充分的明显块状物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次数至溶液完全澄清。对于富含RNase的样品，裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
• 加入等体积结合液至裂解液中，轻轻颠倒混匀3-5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。
• 将混合物(包括沉淀物)转移至纯化柱内，12,000g离心30秒，倒弃收集管内液体。
  注意：当裂解液的体积大于300μl时，在加入等体积结合液后，总体积会超过纯化柱的容量，这时应分成2次过柱，即将一半的混合物过柱后，再将剩余的混合物重复步骤3一次。对于一些特殊的样品，如出现溶液未完全通过时，可延长离心时间至1-2分钟，或者加大离心力至16,000g。对于一些能快速启动达到12,000g的离心机，离心30秒已经足够，对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30秒离心宜调整为60秒。
• 加入600μl洗涤液I，12,000g离心30秒，倒弃收集管内液体。
• 加入600μl洗涤液II，12,000g离心30秒，倒弃收集管内液体。
• 重复步骤5一次。
• 最高速(约14,000-16,000g)离心2分钟，去除残留的液体。
• 将RNA纯化柱置于本试剂盒提供的RNA洗脱管中，加入30-50μl洗脱液，室温放置2-3分钟，最高速离心30秒，所得溶液即为纯化的RNA。
  注意：洗脱液需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μl，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15-40%的RNA。

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名称：非冻型血液RNA保存液
货号：BTN111202
规格：250mL
由于血液富含RNase，因此血液RNA非常容易降解，是临床分子生物学研究中的一个棘手的问题。为解决此问题，本公司在非冻型组织RNA保存液的基础上，开发了本产品。

产品特点：
1.能快速渗透到新鲜血液细胞内，抑制RNA分子的降解。保存的血液RNA常温可放置3天，4℃可放置5天，-20℃可放置3个月。
2.操作简单，直接将本产品和新鲜血液细胞沉淀按比例混合即可。
3.适用于人新鲜血和哺乳动物新鲜血液，不适用于陈旧血液和冻凝血液，也不适用于禽类血液和其他动物血液。
4.重复性好，效果跟进口同类产品相当。
5.保存的样品可直接用本公司血液RNA提取试剂盒提取RNA。

储存条件：室温运输及保存，有效期两年。

使用方法：
注意：RNase污染无处不在，最好用本公司的高效无毒固相RNase清除剂处理RNA工作区域，千万不要使用烷基化试剂DEPC(相当于芥子气)。

一:以白细胞为材料的保存方法(此法效果好于全血保存法)
1.室温1500-2000g离心新鲜抗凝血液10-15分钟，最上层为血浆，最下层为红细胞，中间层为膜状的、含白细胞的Buffy Coat(含白细胞多的血液此层可能很厚)。
2.吸出血浆后，小心将中间的白细胞层吸出(允许污染部分红细胞)到新的离心管中，加入5-10倍体积的本产品，混匀后放常温(不超过30℃)保存不超过3天或者放-20℃保存3月(放-20℃前需要现在4℃放置过夜，然后再离心去除保存液，最后再把细胞沉淀放到-20℃。如果直接放入-20℃，冰晶会刺破白细胞，释放出其中的RNA，在后续实验去掉上清时会丢失)。

二：以EDTA抗凝全血为材料的保存方法
3.将血液取到EDTA抗凝管中后，迅速将0.5mL血液与1.5mL本产品混合，充分颠倒混匀，然后放常温(不超过30℃)保存不超过3天或者放-20℃保存3月(放-20℃前需要现在4℃放置过夜，然后再离心去除保存液，最后再把细胞沉淀放到-20℃。如果直接放入-20℃，冰晶会刺破白细胞，释放出其中的RNA，在后续实验去掉上清时会丢失)。

三：血液RNA的提取(本产品不含RNA提取试剂。此处以本公司的跟Trizol相当的动物RNA提取试剂盒操作步骤为参考。用户也可以使用其他RNA纯化试剂)
4.提取RNA时，如果保存的白细胞在-20℃，则需要先室温化冻，如果保存在常温或4℃，则直接使用。
5.取1.8mL混合液到新的2mL离心管中，5000g室温离心1分钟。
6.小心吸弃上清液(本产品)，细胞将形成沉淀(如果样品时全血，沉淀中将含有大量血液蛋白)。注意：上清一般会很浑浊，一定要尽可能弃尽。有时沉淀上面有白色晶体出现，属于正常现象。
7.在细胞沉淀中加入动物RNA提取试剂盒1mL溶液A，剧烈震荡30秒(不能感觉到震荡即可，一定要看见管底液体旋转起来，否则只是液体表面的震动，下同)。震荡后颠倒几次看溶液是否均匀，如果有颗粒状物体说明还需要震荡裂解。
8.室温放置5分钟以使细胞充分裂解。
9.将0.2mL自备的氯fǎng加入到离心管中，剧烈震荡30秒。
10.12000～15000g4℃离心3分钟。一般上清为无色的水相(含RNA，约0.5-0.9mL)；中间层为白色，含有DNA、蛋白质和其他细胞破碎物，不要触及；下层为有机相，一般呈深红色。注意：有时水相比重大于有机相，出现反相现象，此时应该取下面的水相。
11.小心将水相转移到另一自备的1.5mL塑料离心管中。如果水相超过0.75mL，则需要分成2管，否则在下步没法加入等体积的异丙醇。
12.加入等体积的异丙醇到水相中，充分颠倒混匀。
13.12000～15000g4℃离心10分钟沉淀RNA。
14.吸弃上清。注意：如果离心后出现两个相，则需要吸弃上面的一相，然后在下相(含RNA)中加入一倍体积的超纯水和一倍体积的异丙醇，混匀后12000～15000g4℃离心10分钟沉淀RNA，吸弃上清。
15.将75% RNase-free乙醇加入到RNA沉淀中，震荡几秒后12000～15000g4℃离心1分钟。
16.弃上清
17.12000～15000g4℃离心半分钟，用移液枪去除残留的液体。
18.将20-50μL DEPC处理的水加入到沉淀中并吹打溶解，立即用于下述完整性、产率和纯度的检测，也可直接用于后续RT-PCR等试验或存放于-80℃待用。

四:RNA的检测(列出步骤仅供参考，本产品不提供相关产品)
19.RNA完整性的电泳检测：强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶中单链RNA分子会自生折叠成各种形状，尤其不能使用DNA上样液，因为没有经过去RNase处理。
20.RNA产量产率测定：将5-10μl RNA用TE缓冲液(pH8.2)稀释10倍后检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度X体积)和产率(RNA产量/组织用量)。人血RNA产率一般为2-5μg/mL。
21.RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在2.0左右(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

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