5×RT-qPCR MasterMix(探针法,含UDG酶)

特别提示：包括5×RT-qPCR MasterMix(探针法,含UDG酶)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：5×RT-qPCR MasterMix(探针法,含UDG酶)
英文名称：5×Probe RT-PCR MasterMix(UDG)
产品货号：MT0128
产品规格：20μL×250T|20μL×1000T

本制品将抗体封闭的热启动Taq DNA聚合酶、MLV反转录酶、Rnase Inhibitor、UNG酶、反应Buffer、dUTP/NTP Mixture等试剂预混在一起，是一种5×浓度的单组分预混试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单，只需加入引物、探针、模板、水即可。

该制品中DNA聚合酶为抗体封闭的热启动Taq DNA聚合酶，该酶在50℃以下无活性，只有95℃加热后才能完全恢复活力。在以RNA为模板时，在50℃条件进行反转录反应，再进行95℃加热并启动PCR反应。

由于PCR对核酸的扩增效率极高，在诊断PCR实验中，非常容易造成移液器、台面、PCR仪、空气等气溶胶污染。当实验环境被污染后，会导致阴性样本的假阳性结果。在该Probe qPCR Mix中，将dNTP中的dTTP全部更换为dUTP，从而使得扩增后的PCR产物中包含dU碱基。在随后的实验中，含有气溶胶污染的dU PCR产物，将被本试剂中的UNG糖基化酶降解，从而去除了气溶胶的污染效应，本试剂中的UNG酶在37℃孵育2分钟，即可消除高达10万个Copy的核酸污染物。

产品特点：
· 热启动酶采用抗体封闭，100%热启动；
· 引入UNG，可高效消除气溶胶污染；
· 单组份预混液，使用方便快捷；
· 高特异性，有效抑制非特异性扩增；
· 高灵敏度，可检测低丰度基因；
· 适用于所有实时定量PCR仪器。

产品组成：
 

组分	20μL×250T	20μL×1000T
5×Probe RT-PCR MasterMix(UDG)	1mL	1mL×4
50×ROX Reference Dye	200μL	200μL×2

保存条件：4℃可保存1年。

操作方法：

1．进行RNA的One-Step qPCR检测进行RNA的qPCR检测时，检测模板为RNA，在反转录酶的作用下，由下游引物进行反转录反应，反转录反应完毕后获得cDNA，再启动PCR的扩增，并对cDNA进行扩增，整个过程在一种试剂中一步完成（One-Step qPCR）。
按照如下组分配制20μl PCR反应体系：

 

成分	用量	终浓度
5×Probe RT-PCR MasterMix(UDG)	4μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.8μl	0.4μM
PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μl	0.4μM
TaqMan Probe (10μM)	0.4μl	0.2μM
RNA模板	0.5~2μl
ddH2O	Up to 20μl

注意：ABI 7300/7500/Step One Plus等定量PCR要求加入ROX内参染料，因此该类机型进行实验时，需要在反应体系中加入0.4μl的50×ROX Reference Dye。

2．RNA的One-Step qPCR反应程序如下：

 

步骤	温度	时间	说明	循环数
Stage 1	37℃	2min	1	消化污染物
Stage 2	50℃	10min	1	反转录获得cDNA
Stage 3	95℃	2min	1	热启动PCR
Stage 4	95℃	10s	30～40
	60℃	30s		收集荧光信号

3．反应结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线盒

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