T7 RNA聚合酶

特别提示：包括T7 RNA聚合酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：T7 RNA聚合酶
英文名称：T7 RNA Polymerase
产品货号：MT0129
产品规格：5KU|25KU

T7 RNA聚合酶对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，并可以其作为启动子，DNA作为模板体外合成正义链或反义链RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。

正义或反义RNA链取决于模板DNA序列与T7启动子的位置，DNA位于T7启动子的下游，T7 RNA聚合酶会转录出正义RNA，反之则为反义RNA链。

产品组成：
 

组分	5000U	25000U
T7 RNA Polymerase (50U/μl)	100μL	500μL
5×T7 Transcription Buffer	1mL	1mL×5

储存：-20℃可保存2年，避免反复冻融。

1×T7 Transcription Buffer：
40mM Tris (pH7.8),20mM NaCl,18mM MgCl2,2mM Spermidine HCl,10mM DTT。

贮存液：
10mM Tris-HCl,0.1M NaCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,50% Glycerol,0.01% (w/v) Triton X-100,pH7.5。

活性定义：
在标准反应体系下，37℃ 1小时内将1nmol的ATP掺入酸不溶物所需要的酶量定义为一个活性单位。

热失活：70℃，10min。

其它体外转录辅助试剂：
 

名称	货号
rNTP混合液（25mM Each）	MT0121
RNase Inhibitor（40U/μl）	MT0014
RNase-Free DNase I	MT0090
耐热无机焦磷酸酶	MT0099
RNA快速纯化试剂盒	MT0126
Poly(A)聚合酶	MT0004

使用方法：

1．配制反应体系
 

成分	用量
5×T7 Transcription buffer	4μL
rNTP Mixture（25mM each）	3.2μL
Linearized template DNA	0.2～1μg
RNase Inhibitor（40U/μl）	0.5μL
T7 RNA Polymerase (50U/μl)	1～2μL
RNase-Free H2O	up to 20μl

2．37℃孵育1-3h。

3．使用RNase-Free Dnase I去除DNA模板（可选）在体外转录反应结束后，向上述20μl反应液中加入5μl的10×RD Buffer和2μl RNase-Free DNase I(10U/μl)，并加入23μl的RNase-Free H2O至50μl，37℃孵育15min。

4．转录产物的纯化，体外转录产物可选用RNA快速纯化试剂盒进行柱式纯化，以去除多余的盐、蛋白等杂质。也可以采用经典的LiCl沉淀法。

注意事项：
1．转录DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。
2．转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RNase A会显著影响转录RNA的质量。通过酚-lǜ仿抽提的质粒DNA为最佳模板。
3．该酶对高浓度NaCl或KCl不耐受，当其浓度高于150mM时，其活性受到显著抑制（~50%）。
4．在20μl反应体系中加入0.02U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量（提高25～50%）。

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特点：T7 RNA Polymerase可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T7启动子有高度的特异性。

用途：用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定(RNase protection assay)，反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。

活性定义： 37℃60分钟内，催化1 nmol AMP掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl2，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，0.6MBq/ml[3H]-ATP，20μg/ml plasmid DNA containing the specific T7 RNA Polymerase promoter sequence。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，5mM DTT，0.1mg/ml BSA，0.5mM Elugent，50% glycerol。
Transcription Buffer(5X)：200mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，30mM MgCl2，50mM DTT，50mM NaCl，10mM spermidine。
失活或抑制：70℃加热10分钟可使T7 RNA Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使T7 RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制T7 RNA Polymerase的活性。

储存条件：-20℃

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