核苷二磷酸激酶

特别提示：包括核苷二磷酸激酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：核苷二磷酸激酶
英文名称：Yeast Nucleoside diphosphokinase(20 U/μl)
产品货号：MT0166
产品规格：1000U

核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase,NDPK)催化腺苷三磷酸（ATP）和核苷二磷酸（NDP）之间高能磷酸基团的转移，在体内负责合成除ATP以外的其它核糖核苷酸的生成。由二核糖核苷酸生成三核糖核苷酸：(d)XDP+(d)YTP→(d)XTP+(d)YDP。另外，该酶还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性，并参与转录调控和信号转导。该蛋白来源于S.cerevisiae，通过重组表达而得。

产品组成：
 

组分	规格
Yeast Nucleoside diphosphokinase(20U/μl)	50μl
10×NDPK Buffer	1ml

保存：-20℃可保存3年。

10×NDPK Buffer：
200mM HEPES,pH7.5
1M Potassium glutamate
100mM Magnesium acetate
50mM DTT

活性定义：
每单位指37℃条件下，在ATP存在条件下每分钟转化1.0 μmol TDP到TTP所需酶量。该酶比活为1X10e5U/mg，制品浓度约200ng/μl。

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名称：BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)
货号：YT393
规格：2000U
本制品是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶(RNase H^-)。和普通的M-MuLV反转录酶相比，BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成；但缺失了Ribonuclease H(RNase H)酶活性，不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA。BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)是最常用的反转录酶之一。

本产品中M-MuLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl，用于20μL反转录体系时足够进行10次反转录反应。

产品特点：
 

• BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)可以合成长达13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反转录酶(RNase H^-)仅能合成长达9kb的cDNA；
• BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)的最适反应温度为42-45℃并且在55℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反转录酶(RNase H^-)在37℃反应时的一些不足。

产品用途：
 

• BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。
• BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
• BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)也可以用于DNA探针的标记，通过引物延伸(primer extention)来分析RNA，以及用于基因芯片荧光探针的标记。

来源：
本BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)由大肠杆菌表达，表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片段。

活性定义：
One unit of the enzyme incorporates 1nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10min at 37℃。

活性检测条件：
50mM Tris-HCl(pH8.3),6mM MgCl₂,10mM DTT,40mM KCl,0.5mM dTTP,0.4 MBq/ml [³H]-dTTP,0.4mM polyA·oligo(dT)_12-18。

质量控制：
不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。

酶储存液：
50mM Tris,pH8.3,100mM NaCl,1mM EDTA,5mM DTT,0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。

5×Reaction Buffer：
250mM Tris,pH8.3 at 25℃,250mM KCl,20mM MgCl₂,50mM DTT。

失活或抑制：
70℃孵育10分钟可以导致BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)有抑制作用。

产品组成：
 

组分	规格
BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)	2000U
5×Reaction Buffer	200μL

保存条件：-20℃保存。

使用说明：
1．cDNA第一条链的合成：
 

• 参考如下表格设置反转录反应：
   

  模板(后面3种任选一种)	Total RNA	0.01-5μg
  	或Poly(A) RNA/mRNA	1-500ng
  	或Specific RNA	0.01pg-500ng
  引物(后面3种任选一种)	Oligo(dT)18	0.5μg (或100pmol)
  	random hexamer	0.2μg (或100pmol)
  	Gene specific primer	15-25pmol
  DEPC-treated Water	－	To 13.7μl①
  Reaction Buffer (5X)	－	4μl
  RNase Inhibitor	－	0.5μl②
  dNTP Mix (25mM each)	－	0.8μl③
  BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H-)	－	1μl
  总体积		20μl

  
  ① To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。
  注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，加入DEPC-treated Water混匀后微离心，接着可以在65℃孵育5分钟，随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
  ② RNase Inhibitor可以视其本身的情况加入适当的量，例如0.5μl或其他适当体积。在加入其他体积时，DEPC-treated Water的用量需适当调整。
  ③ dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
• 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。
• 如果使用Oligo(dT)₁₈作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用random mhexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。
• 70℃孵育10分钟以失活BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)并终止反转录反应。说明：对于长片段的cDNA不推荐采用加热的方法失活BalbRT M-MuLV反转录酶(RNase H^-)，这种操作可能会导致部分长片段DNA被剪切。
• 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为50微升，则推荐使用2微升反转录产物。

2．其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶(RNase H^-)的相关文献资料进行。

常见问题：

1．总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。

2．反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。

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