SARS-CoV-2新型冠状病毒荧光定量试剂盒

特别提示：包括SARS-CoV-2新型冠状病毒荧光定量试剂盒(N基因，探针法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：SARS-CoV-2新型冠状病毒荧光定量试剂盒(N基因，探针法)
英文名称：SARS-CoV-2 N Gene Probe RT-qPCR Kit
产品货号：BTN15-81920
产品规格：50次

本试剂盒根据探针法qRT-PCR原理开发，用于体外检测人鼻咽拭子、痰液及肺泡灌洗液中的新型冠状病毒的N基因，仅作为应对SARS-CoV-2感染的肺炎疫情期间的体外诊断应急使用。在使用上应遵守《中国CDC新冠肺炎实验室检测技术指南》、《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案》等文件（现行版）的相关要求。可用于科研领域快速检测2019新型冠状病毒。

试剂盒特点：
1．即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2．引物和探针经过优化，灵敏性高。
3．提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4．特异性高，引物是根据SARS-CoV-2冠状病毒N基因保守区设计，具有较高特异性。
5．本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。
6．本产品只能用于科研。

试剂盒组成：
 

组分	规格
探针法RT-qPCR缓冲液	500μL
探针法RT-qPCR酶混合液	100μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR引物混合液	100μL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR探针	50μL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR阳性对照 (1×108拷贝/μL)	50μL

保存条件：-20℃保存，保存期限为12个月。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以10²-10⁷拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。
由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1．标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2．用带芯枪头分别加入45μL荧光RT-qPCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3．在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4．换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5．换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6．重复上面的操作直到得到

二、样品RNA的制备
7．如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8．用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNA试剂盒。

三、Probe RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9．如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10．在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
 

成分	样品管N+2个	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照
探针法RT-qPCR缓冲液	各10μL	10μL	各10μL
探针法RT-qPCR酶混合液	各2μL	2μL	各2μL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR探针	各1μL	1μL	各1μL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR引物混合液	各2μL	2μL	各2μL
待测样品RNA模板	各5μL	-	-
超纯水	-	5μL	-
标准曲线样品稀释液(2-7号)	-	-	各5μL

11．盖上盖子后上机，上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。
 

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30min
预变性	94℃	10min
RT-qPCR反应（40个循环）	94℃	15sec
	90℃	1min（采集FAM通道的荧光信号）

四、数据处理
12．如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
13．如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于37则为阳性。如果在37-40之间，则重复一次。若重复结果Ct值小于40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

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