通用型RT-LAMP试剂盒(双染料)

特别提示：包括通用型RT-LAMP试剂盒(双染料)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：通用型RT-LAMP试剂盒(双染料)
英文名称：Fluorescent and Visual RT-LAMP Kit
产品货号：BTN200603
产品规格：50次

本试剂盒是是基于双染料RT-LAMP技术推出的荧光和可见光双模式RT-LAMP扩增及检测试剂盒，它既可以用于荧光RT-LAMP扩增及检测，也可以用于可视化RT-LAMP扩增及检测，适用于各种针对核酸的快速定性检测。

试剂盒特点：
1．一般60分钟内出结果（取决于靶分子浓度），比RT-PCR快约1小时。
2．对20μL的反应体系，最大样品加样量达到14μL。
3．含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
4．内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
5．特异性比RT-PCR高，因为RT-LAMP扩增使用4-6条引物而不是两条。
6．灵敏性可达10拷贝/反应以下（随引物而不同），故假阴性率更低。
7．只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
8．本产品只适用于RT-LAMP检测，不适用于进行RT-LAMP检测。
9．本产品足够50次20μL体系的荧光及可视化RT-LAMP扩增。

试剂盒组成：
 

组分	规格
4×RT-LAMP MagicMix	250μL（绿盖）
4×阳性对照及引物	50μL（黄盖）

保存：-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂：
RT-LAMP模板及RT-LAMP引物、PCR级石蜡油（仅对使用金属浴或水浴者）。

使用方法：

准备工作：
如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。本公司发现很多水浴锅或金属浴温度不准，故建议先用阳性对照和阴性对照测试所用仪器在60℃、62.5℃、65℃、67.5℃和70℃五个温度下扩增效果，选择阳性和阴性颜色差异最大的温度进行扩增。

一、样品RNA的制备
1．用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，可以选购本公司的各种免提取试剂盒，不同样本选择不同货号的产品，如有需要请联系我司选购。
2．如果有N个样品，则至少需要做N+2个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后N+2个样品一起进行RNA提取操作，得到N+2个RNA样品。

二、配制并测试自备的20×RT-LAMP引物混合液
3．用超纯水将自备的6种（或4种）RT-LAMP引物干粉稀释到母液浓度（100μM），然后按下表配制100μL的20×RT-LAMP引物混合液，此混合液足够100次20μL体系的RT-LAMP扩增。如果需要配制的20×RT-LAMP引物混合液体积异于100μL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
 

引物名称	母液浓度	加母液量	在20×RT-LAMP引物 混合液中的浓度
FIP引物	100μM	32μL	32μM
BIP引物	100μM	32μL	32μM
F3引物	100μM	4μL	4μM
B3引物	100μM	4μL	4μM
Loop F	100μM	8μL	8μM
Loop B	100μM	8μL	8μM
超纯水	-	12μL	-

注意：总体积为100μL。如果自备的RT-LAMP引物不含Loop引物，则按上表配制时Loop用超纯水替代，使得总体积为100μL。

4．测试引物的非特异扩增：在加模板和不加模板（至少1000拷贝/反应）的RT-LAMP系统中测试引物效果，引物选择标准可以自己掌握，最好选择无模板反应的Ct值比有模板反应的Ct值大60以上（每个循环1分钟）的引物对。根据结果设定判断阴性和阳性结果的阈值（本产品只用于定性）。
如果没有qPCR仪器，只能用肉眼检测，则无需设定阈值，届时靠跟阳性对照和阴性对照管的颜色来判断。

三、RT-LAMP扩增（20μL体系）
5．反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+5个RT-LAMP扩增，增加扩增阳性对照、无模板对照和无引物对照各1个。在N+5个0.2mL的PCR管中加入下列成分：
 

成分	N+2个 样品管	无模板 对照管	无引物 对照管	扩增 阳性对照管
4×RT-LAMP MagicMix	各5μL	5μL	5μL	5μL
自备20×引物混合液	各1μL	-	1μL	-
自备N+2个样品RNA	最多14μL	同样品管	-	-
4×阳性对照及引物	-	-	-	5μL
超纯水	补到20μL	补到20μL	14μL	10μL

6．混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列两种方式进行扩增和检测。
7．如果使用金属浴、水浴或普通PCR仪，如果没有热盖，则必须先在每个反应管中加30μL石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率和颜色显示。65℃保温120分钟。
8．如果使用荧光定量PCR仪：聚合温度设为65℃，1次循环1分钟，120个循环，每分钟在FAM通道采集一次荧光信号。

四、结果分析及解读
9．所有阳性对照有阳性结果（Ct在阈值以内或反应液呈蓝色），所有阴性对照有阴性结果（Ct大于阈值或反应液呈淡蓝色），否则提取实验或扩增实验无效。需要寻找原因或跟厂家联系，暂时不需要分析样品的结果。
10．如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。如果肉眼观察，样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增有靶分子，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增无靶分子。反应结果示例如下（9为阴性，10为阳性）：

11．如果是用荧光PCR仪，样品Ct将小于阈值则为阳性，大于阈值则为阴性。
12．当实时荧光检测和可视化检测同时使用时，如果不一致，以实时荧光RT-LAMP的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果20-30分钟，也就是说，在qPCR仪上第30分钟时呈现阳性的样品，其颜色变化在第50-60分钟时才能观察到。

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货号	名称	规格
BTN130833	LAMP可见光染料	1mL
WE0132	cDNA第一链合成试剂盒	100次
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JN0061	RNA/单链DNA染料(SYBR Green)	500μl
QN0956	通用引物 ITS1	250μl(10uM)
QN0969	2×Pfu PCR MasterMix (含染料)	1ml|5ml

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