单链DNA PAGE电泳染色试剂盒

特别提示：包括单链DNA PAGE电泳染色试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：单链DNA PAGE电泳染色试剂盒
英文名称：ssDNA PAGE Stain Kit for Nucleic Acids
产品货号：RFT204
产品规格：20次

单链DNA PAGE电泳染色试剂盒是一种快速简单、可用于尿素-聚凝胶中的核酸检测的试剂盒。采用新型染色剂，电泳结束后可以直接染色凝胶，不用借助任何成像仪器，既能观察核酸条带。该方法能检测到下限10ng的ssDNA条带，常用于检测SSR标记、SNP标记等。
按照每次使用50mL染色液计算，本试剂盒可用于18-20块常规的8×10cm凝胶的染色。
产品组份：
 

组分	规格	保存条件
染色贮存液（10×）	100mL	RT
染色缓冲液（5×）	250mL	RT
125mL棕色塑料瓶（空）

保存条件：
常温保存；常温运输，开封后一年有效。

使用方法：
一、即用型染色液配制：
在125mL棕色塑料瓶中依次加入以下组份，混匀；即用型染色液常温贮存。
 

顺序	组分	50mL
1	染色贮存液（10×）	5mL
2	超纯水	35mL
3	染色缓冲液（5×）	10mL

二、染色步骤：
1、ssDNA PAGE电泳后，凝胶用蒸馏水漂洗1-2次。
2、加入适量即用型染色液覆盖凝胶，一般8×10cm凝胶50mL即可，在摇床上常温摇动15-20分钟，摇动速度为60-70rpm。一般2-5分钟可以看到条带。
三、脱色步骤：
倒掉染色液，加入适量蒸馏水，在摇床上常温摇动15-20分钟，期间可以更换2-3次蒸馏水；至凝胶背景透明后记录图片。
【注】：
● 染色时间不要太长，更不能过夜染色。长时间染色会导致ssDNA游离出凝胶，导致胶上无带。
● 使用后的染色液收集后，可以重复使用2-3次。
实验示例：



15% Urea-PAGE 1×TBE 200V 55min
Lane 1-7为20,25,30,35,40,50,75nt ssDNA上样量为1μg
Lane 8,9,10 ssDNA Marker上样量为5μL

常见问题：
● 背景太深：
显色时间过长。通常凝胶在染色液里2-5分钟既能看到条带，显色反应会在20分钟内结束，显色反应时间过长会蓝色背景很深。
● 核酸条带非常浅：
上样量太少。该染色方法可以检测到10ng单链DNA片段，请控制核酸上样量。
● 染色方法适合于双链DNA染色吗？
不适合。双链DNA的分离一般用非变性DNA PAGE电泳，该染色液不能有效染色。

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名称：一站式DNA非变性PAGE电泳套装
货号：BTN100205
规格：30次
本品就是专门用于非变性PAGE的试剂。非变性PAGE电泳是研究SSCP-PCR(single-strand conformation polymorphism-PCR、单链PCR片段构象多态性)和凝胶滞阻(Gel Shift)的重要研究手段，因为在非变性PAGE中，DNA的迁移率除跟长短相关外，还跟其构象和结合的蛋白质相关。

产品特点：
1.一站式，用户只需要准备水和样品，十分方便。
2. 安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品。
3. 灵活，高浓度的溶液可用于配制各种浓度的PAGE胶，分开提供的和甲叉双可用于配制各种交联度的PAGE胶。
4. PAGE电泳后可直接用于银染等后续试验。

产品组成：
 

成分	规格	保存
	60g	室温
甲叉双	2g	室温
TEMED	1.5ml	4℃，避光
过硫酸铵(干粉)	1g	室温
非变性PAGE上样液，2×	1ml	4℃
10×TBE(BTN90313)	250ml	室温
说明书	1份

储存条件：常温运输，保存条件见上表，有效期一年。

使用方法：
用于SSCP-PCR分析的非变性PAGE电泳(其他应用请相应修改参数)

一、PAGE浓度的选择：最好使用浓度为5-12%的胶，因为SSCP-PCR的扩增长度一般在150-200bp之间，而5%的PAGE的有效分辨范围为80-500bp、8%的PAGE的有效分辨范围为60-400bp、12%的PAGE的有效分辨范围为40-200bp。

二、PAGE交联度的选择：交联度越低，孔径越大，对DNA分子构象的变化越灵敏，SSCP分辨率越高，但过低则胶太软，不好进行电泳后的后续操作，所以一般选择1-2%的交联度(即：甲叉双在49:1到48:2之间)。

三、体积的选择：SSCP-PCR检测需要长约30-40cm的测序胶板，可以结合梳子的厚度，计算胶的体积。
操作：
1. 配制PAGE胶(这是配制100mL胶的用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加)
A：新鲜配制10%的APS(过硫酸铵)：按每0.1克过硫酸铵干粉加1mL超纯水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的1.5mL EP管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的10%的APS溶液可以在4℃存放一周。
B：新鲜配制适当交联度29:1的30%的-甲叉双溶液(AB溶液，下同)：在本产品提供的装有60 g干粉的塑料瓶中加入146mL自备的去离子水和全部的甲叉双，充分摇晃直到溶解(约需10-20分钟)，即得到30%的AB(29:1)溶液。此溶液最好在一个月内用完，必须4℃避光保存。
C：配SSCP PAGE胶：在一个250mL的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB溶液溶液和10×TBE缓冲液。单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。
 

PAGE胶浓度	各成分用量(单位：ml)			总体积(ml)
	去离子水	30%AB溶液	10×TBE缓冲液
5%	73.4	16.6	10.0	100
6%	70.0	20.0	10.0	100
7%	66.7	23.3	10.0	100
8%	63.3	26.7	10.0	100
9%	60.0	30.0	10.0	100
10%	56.7	33.3	10.0	100
11%	53.3	36.7	10.0	100
12%	50.0	40.0	10.0	100

注：有大量文献报道PAGE胶中加入5%-10%的甘油能提高某些位点的分辨率。如果选择加入10%的甘油，则减少去离子水的用量10mL，同时加入10mL甘油。
D：摇晃混匀。最好能抽真空10-15分钟以去除溶液中的氧气(氧气能抑制聚合反应)，无条件也可以不脱氧。
E：加入500μL 10%APS和100μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
F:在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
G:室温聚合30-60分钟(低温抑制聚合反应)。
H: 拔出梳子，用1×TEB液冲洗加样孔。
I: 放4℃冰箱预冷30分钟-12小时。为了防止胶收缩，最好顶部加少量1×TBE缓冲液。预冷的胶有利于保持单链DNA的构型。
2. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TEB电泳液。
3. 取3-5μl SSCP-PCR样品，加入等体积2×非变性PAGE上样液，85℃处理5分钟后冰浴。用前短暂离心后取2μl上样。
4.连接电源线，打开电源开关。如果PAGE中不含甘油，则使用25W的功率，电泳5-7小时(对3—40cm长的PAGE胶而言)。如果使用含甘油的PAGE，则使用8W的功率，电泳16-18小时。由于温度变化过大会改变DNA构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的PAGE，最好恒温在4℃、对含甘油的PAGE，最好恒温在25℃。
5. 终止电泳，取出凝胶进行后续的处理(如银染)。

疑难解答：
一、为何SSCP-PCR带型有复合条带？
原因之一：可能是残留的PCR引物跟单链的DNA结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
原因之二：可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
二、如何提高电泳分辨率？
可以在配胶时加入甘油(终浓度为5%-10%)，因为甘油是弱变性剂，能部分展开DNA折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合室温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。

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