耐热反转录酶

特别提示：包括耐热反转录酶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：耐热反转录酶
英文名称：ThermoStable Reverse Transcriptase
产品货号：MT0120
产品规格：10kU|50kU

本耐热反转录酶是在鼠源病毒反转录酶基础上进行定点突变改良而得。该酶去除了RNase H活性中，从而避免反转录过程中降解RNA。同时经过突变文库筛选，使得其热稳定性更强，可耐受65℃高温反应。相比于低温条件下反转录反应，采用高温反转录可显著打开RNA二级结构，从而提高复杂RNA模板的扩增性能、提高反转录cDNA的长度和产量，从而提高后续检测的灵敏度。

产品组成：
 

成分	10000U	50000U
耐热反转录酶(200U/μl)	50μl	250μl
5×RT Buffer	1ml	1ml×10

储存：-20℃可保存2年。

单位定义：
以poly(rA)为模板、oligo(dT)为引物，在37℃条件下，10分钟内催化1nmol的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需要的酶量，定义为一个活性单位。

反应实例：
以人RNA为模板，应用耐热反转录酶和M-MuLV反转录酶分别在50℃、55℃、60℃和65℃进行反转录反应，反应时间为15min，然后进行PCR扩增获得542bp的片段。


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名称：RNase A溶液(10mg/mL)
货号：BTN3160
规格：1.5mL
本产品是浓度为10mg/mL的RNase A溶液，不含DNase和蛋白酶活性，可以用于DNA提取(包括质粒DNA提取)时和蛋白质纯化时去除RNA污染。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。


名称：核酸外切酶T
货号：BTN130627
规格：250U
核酸外切酶T(Exo T)又称核糖核酸酶T(RNase T)，沿 3′→5′方向特异性作用于单链RNA或DNA的3′突出末端。核酸外切酶T作用于3′突出末端，产生RNA或DNA分子的平末端。

产品特点：
?特异地作用于单链DNA或RNA；
? 使DNA或RNA的3′突出端变为平齐末端；
? 无核酸内切酶和外切酶污染。

产品组成：
 

成分	规格
核酸外切酶(5000U/mL)	50μL
10×Buffer	1ml
使用手册	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期半年。

热失活：65℃ 加热 20分钟。

活性定义：1单位指 100μl反应体系中，25℃条件下，30分钟从1nmol[3H]-标记的多聚胸腺嘧啶生成0.1nmol TCA可溶性DNA所需要的酶量。

名称：BalbRT M-MuLV反转录酶
货号：YT392
规格：2000U
本制品是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶。和普通的M-MuLV反转录酶相同，BalbRT M-MuLV反转录酶也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成；同时具有Ribonuclease H(RNase H)酶活性，可以选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，但不剪切单链RNA或双链RNA。

特点：
 

• BalbRT M-MuLV反转录酶可以合成长达13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反转录酶仅能合成长达9kb的cDNA；
• BalbRT M-MuLV反转录酶的最适反应温度为42℃并且在50℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反转录酶在37℃反应时的一些不足。

用途：
 

• BalbRT M-MuLV反转录酶常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。
• BalbRT M-MuLV反转录酶合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
• BalbRT M-MuLV反转录酶也可以用于DNA探针的标记，以及通过引物延伸(primerextention)来分析RNA。

产品组成：
 

组分	规格
BalbRT M-MuLV反转录酶(200U/μl)	2000U
5×Reaction Buffer	0.2ml

保存条件：-20℃保存。

来源：
本BalbRT M-MuLV反转录酶由大肠杆菌表达，表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片段。

活性定义：
One unit of the enzyme incorporates 1nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10min at 37℃.

活性检测条件：
50mM Tris-HCl(pH8.3),6mM MgCl₂,10mM DTT,40mM KCl,0.5mM dTTP,0.4 MBq/ml [³H]-dTTP,0.4mM polyA·oligo(dT)_12-18。

质量控制：
不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含BalbRT M-MuLV反转录酶本身含有的RNase H酶活力以外的RNA酶，满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。

酶储存液：
50mM Tris,pH8.3,100mM NaCl,1mM EDTA,5mM DTT,0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。

5×Reaction Buffer：
250mM Tris,pH8.3 at 25℃,250mM KCl,20mM MgCl₂,50mM DTT。

失活或抑制：
70℃孵育10分钟可以导致BalbRT M-MuLV反转录酶失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BalbRT M-MuLV反转录酶有抑制作用。

使用说明：

1．cDNA第一条链的合成：
 

• 参考如下表格设置反转录反应：
   

  模板(后面3种任选一种)	Total RNA	0.1-5μg
  	或Poly(A) RNA/mRNA	10-500ng
  	或Specific RNA	0.01pg-500ng
  引物(后面3种任选一种)	Oligo(dT)18	0.5μg (或100pmol)
  	random hexamer	0.2μg (或100pmol)
  	Gene specific primer	15-25pmol
  DEPC-treated Water	－	To 13.7μl①
  Reaction Buffer (5X)	－	4μl
  RNase Inhibitor	－	0.5μl②
  dNTP Mix (25mM each)	－	0.8μl③
  BalbRT M-MuLV反转录酶	－	1μl
  总体积		20μl

  
  ① To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。
  注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，加入DEPC-treated Water混匀后微离心，接着可以在65℃孵育5分钟，随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
  ② RNase Inhibitor可以视其本身的情况加入适当的量，例如0.5μl或其他适当体积。在加入其他体积时，DEPC-treated Water的用量需适当调整。
  ③ dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
• 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。
• 如果使用Oligo(dT)₁₈作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。
• 70℃孵育10分钟以失活BalbRT M-MuLV反转录酶并终止反转录反应。说明：对于长片段的cDNA不推荐采用加热的方法失活BalbRT M-MuLV反转录酶，这种操作可能会导致部分长片段DNA被剪切。
• 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为50微升，则推荐使用2微升反转录产物。

2．其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶的相关文献资料进行。

常见问题：

1．总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2．反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。

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