LAMP恒温扩增试剂盒

特别提示：包括LAMP恒温扩增试剂盒(HNB可视染料法,冻干制剂)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：LAMP恒温扩增试剂盒(HNB可视染料法,冻干制剂)
英文名称：Lyophilized LAMP Kit(Visual HNB Dye)
产品货号：MT0153
产品规格：50|1000T

本试剂盒基于LAMP技术，LAMP是一种新型核酸扩增技术，采用4或6条能够识别目的基因上的6个特异区域的引物，依赖于Bst DNA聚合酶的强链置换活性，在30~60分钟内DNA扩增可达10⁹～10¹⁰倍。本试剂盒为冻干制品，相对于液体型产品更加稳定，灵敏度更高，操作更加方便，通常在30min内完成检测。

Bst DNA聚合酶是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有很强的链置换活性，以及5"→3"的DNA聚合酶活性，因此可以应用于LAMP实验。本制品内含Bst DNA聚合酶4.0因此既可以扩增DNA，也可以直接扩增RNA分子。

本试剂盒配备变色反应指示剂，其含有羟基萘酚蓝（HNB）指示染料，阳性扩增样品的颜色由紫罗兰色变为天蓝色。

试剂盒组成：
 

组分	规格(50T)
Lyophilized LAMP HNB Reagent	1瓶
LAMP Buffer	0.75ml

保存条件：-20℃，有效期一年，可常温运输。

反应实例：
以检测非洲猪瘟病毒（ASFV）为例，以标准质粒为模板，用本试剂盒检测，结果如下图


使用方法：

1．Lyophilized LAMP HNB Reagent为干粉形式，包含Bst DNA聚合酶4.0、dNTPs等，在未溶解前，该制品可-20℃长期保存，并可室温运输，性能无下降。使用前每瓶用750μl的LAMP Buffer溶解后，可立即使用，剩余试剂可在-20℃保存1个月，在-60℃以下长期保存。

2．按以下组分配置反应混合液
 

成分	用量
溶解后的LAMP HNB Reagent	15μl
LAMP Primer Mix	1 or 1.5 or 2μl
模板DNA or RNA	1μl
ddH2O	至20μl

首次实验时LAMP Primer Mix分别采用1、1.5、2μl，以阴性不变色，阳性样品正常变色为标准，作为后续测试用量。

3．反应体系配好后，置于60~65℃（首次实验采用60℃）进行反应20~45min（扩增良好的引物组合，通常25min即可变色，一般不超过45min，首次实验设置20、25、30、45min）。
在LAMP反应结束后禁止将反应管盖打开，否则可能会导致气溶胶污染。一旦发生气溶胶污染，请使用百奥莱博的气溶胶DNA污染去除剂（MT3001）进行环境清理。

LAMP实验的条件优化：
1．LAMP Primer Mix浓度：FIP/BIP分别为16μM、LoopF/B分别为8μM、F3/B3分别为2μM。
2．四个重要的参数，将对成功建立LAMP检测方法至关重要，分别是引物位置、引物使用浓度、反应温度、反应时间。引物使用浓度、反应温度、反应时间是优先要确认的参数，如经过参数调整后仍不能达到检测用标准，则重新设计引物组合，再进行测试。

不同显色方法的LAMP试剂盒的比较：
 

	LAMP TaqMan	LAMP-OTG	LAMP-HNB	LAMP-浊度
货号	MT0158	MT0151	MT0153	MT0152
变色现象	荧光探针切割	橙色变绿色	紫罗兰色变天蓝色	无色变白色浑浊
检测设备	定量PCR仪或恒温荧光检测仪	肉眼可见	肉眼可见	肉眼可见或浊度仪
区分度	极易判读	极易判读	可以判读	相对不明显
灵敏度	单Copy	10Copy	10-50Copy	10-100拷贝
特异性	高特异	比较特异	一般	一般
反应温度	60~63℃	60~65℃	60~65℃	60~65℃
反应时间	15~25min	20~40min	20~40min	20~40min
反应用酶	Bst5.0	Bst4.0	Bst4.0	Bst4.0
综合推荐	★★★★★	★★★★★	★★★	★★
试剂开发难度	较易	较难	非常难	较难

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名称：miRNA cDNA第一链合成试剂盒
货号：BTN130911
规格：25次
本试剂盒采用在miRNA 3′末端加多聚A 尾的方法来使miRNA 具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Tag引物进行逆转录反应，最终合成miRNA 对应的第一链cDNA。其反应流程如下：


产品特点：
1. 两步式操作，先进行Poly(A)加尾，再进行逆转录反应。
2. 只需要1μg的total RNA。
3. 所得cDNA可用于检测多种miRNA，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通量。
4.与miRNA荧光定量PCR 检测试剂盒兼容。
5.特异性好，独特的miRNA引物及反应体系避免了Pre-miRNA的非特异扩增。

试剂盒组成：
 

成分	规格
E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL)	10μl
10×Poly(A)聚合酶反应液	50μl
ATP溶液，1mM	50μl
Oligo(dT)-Tag引物(0.5ug/μL)	25μl
MMLV 逆转录(含RI)	50μl
4×RT Buffer(含dNTP)	125μl
RNase-free 水	1ml

储存条件：低温运输，-20℃保存。

使用方法：

一、对miRNA 3′末端进行加Poly(A)处理
1.在冰上预冷RNase-Free的反应管内加入以下试剂至总体积20μL。注意需要最后加入E.coli Poly(A)聚合酶。
 

试剂组份	体积
自备的Total RNA(见注)	1μg
10× Poly(A)聚合酶反应液	2μl
ATP溶液，1mM	2μl
RNase-Free水	补水至20μL
E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL)	0.4μL(2U)

注：在反应中使用的Total RNA必须含有miRNA。也可以直接使用miRNA(建议加入量为2–5μL，需根据目的miRNA的丰度决定)。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37℃反应60 min。所得的反应液可以直接进行下游实验(注意：只能把2μL 直接用于后续的RT反应，多于2μL 则需要先乙醇-乙酸钠沉淀，再将加尾后的miRNA 溶于水，然后再取所需量用于RT。如果不经过沉淀，带入的残留的poly(A)聚合酶反应液将会干扰RT反应)，也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。

二、对带Poly(A)尾巴的miRNA进行逆转录反应
3. 按照下表设置20μL体系的RT反应：
 

成分	体积
Poly(A)反应产物(来于上步)	2μl
RNase-Free水	10μl
Oligo(dT)-Tag引物	1μl
4×RT Buffer(含dNTP)	5μl
MMLV 逆转录酶(含RI)	2μl

4. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应60 min。
5. 70℃保温10 min 终止反应。
6. 合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以暂时冰上放置，立即用于后续的荧光PCR 定量检测，不需要纯化。

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货号	名称	规格
BTN100839	PCR级甲酰胺	250mg
BTN131227	10nt随机引物(0.5μg/uL)	5μg
YT372	Pfu DNA聚合酶(Pfu酶)	200U|1000U
WE0110	2×Babuddy MasterMix(含染料)	1ml|5ml
WE0130	反转录MasterMix	100次
WE0142	快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)	5ml

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