BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液

特别提示：包括BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液
英文名称：BalbRT III First Strand cDNA Synthesis MasterMix (5X)
产品货号：YTB3012
产品规格：20次|100次|500次

本制品是一种仅需加入RNA模板和水就能进行反转录的最简单、便捷、快速、稳定并且非常高效的cDNA第一链合成产品。本产品对于3kb以下片段，10min就能完成反转录；产物长度可以长达12kb；可以在55℃进行高温反转录，有效解决复杂二级结构RNA反转录难的问题；-20℃不会结冻，取用非常便捷。

BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)包含了经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的BalbRT III M-MLV反转录酶、RNase Inhibitor、Oligo(dT)18 Primer、Random Hexamer Primer、dNTPs、MgCl2和反转录反应缓冲液，只需加入RNA模板和水(DEPC-treated Water或DNase/RNase-Free Water)就能进行反转录反应，大大简化了反转录的实验操作，使操作最为便捷，能有效避免常规反转录非常复杂的操作过程中可能导致的操作误差、孔间污染等，使反转录的重复性和平行性大幅提升。

本产品可广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成，后续可以用于PCR、real-time PCR也称定量PCR (quantitative PCR,qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建，尤其是反转录所得目的基因的克隆等。BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素、地高辛或同位素标记等，也可以通过引物延伸(primer extension)来分析和研究RNA。

BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)中的BalbRT III M-MLV reverse transcriptase，是一种经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的M-MLV反转录酶，具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能够以RNA或DNA为模板，在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成，即可以进行cDNA(complementary DNA)的第一链合成，同时它保留了RNase H的活力，能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，有利于后续cDNA第二链的合成。

本产品经测试可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录，反转录的最大长度可以达到12 kb。BalbRT III M-MLV反转录酶热稳定性好，反转录效率高。本产品最适反应温度为42℃，当温度达到50℃时仍具有很高活性，对于长度较短的cDNA反转录，温度达到55℃时也可获得较高产量的cDNA。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录，能有效减少二级结构，提升反转录效率。反转录速度快，6kb以下的cDNA反转录只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反转录10min即可完成。

本产品反转录效率高，BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)的反转录效率与非预混液的反转录效率一致(参考图1)。

图1.使用百奥莱博的BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)和使用BalbRT III M-MLV反转录酶的常规反转录体系的效果对比图。在20μl的反转录反应体系中，以HEK293T细胞中提取的1μg总RNA为模板，没有加入反转录酶、分别使用BalbRT III M-MLV反转录酶的常规反转录体系和BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)，42℃反转录60min。然后取1μl反转录产物分别进行两个目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR扩增和电泳检测。

如果希望进行常规的反转录操作，可以单独选购BalbRT III M-MLV反转录酶(货号：YTB3010),RNase Inhibitor (货号：YT530)和dNTP mix (货号：YT391)，或者选购BalbRT III cDNA第一链合成试剂盒(货号：YTB3011)进行反转录反应。

本产品操作便捷，作为即用型第一链合成预混反应液(5X)，即反转录预混液(5X)，只需加入模板RNA和水，即可快速进行反转录反应，并且BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)在-20℃不会结冻，使用非常便捷。

本产品重复性好，反转录所有试剂预混合，大大减少操作步骤，有效降低污染几率和操作误差，使实验结果更加一致，重复性更好。

失活或抑制：80℃孵育10min可以导致本产品中的BalbRT III M-MLV反转录酶失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BalbRT III M-MLV反转录酶有抑制作用。

注意事项：
 

• 由于本预混液(5X)含有适量甘油，使用时须注意与RNA样品及水充分混匀，否则可能会导致反转录不充分。
• 对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

一、cDNA第一条链的合成：
 

• 参考如下表格中设置的20μl反转录体系：
   

  RNA	Total RNA	0.1ng-5μg
  	或poly(A) RNA/mRNA	10pg-0.5μg
  	或specific RNA	0.01pg-0.5μg
  DEPC-treated Water	－	To 16μl*
  选择性步骤：如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构，混匀后微离心以把液体沉降至管底，65℃孵育5min，随后立即置于冰上冷却，以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
  BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液	－	4μl
  总体积	－	20μl

  
  *To 16μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为16μl。
• 混匀反应体系(用移液器轻轻吹打数次以充分混匀或用涡旋混合器在较低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
  注：本预混液(5X)含有适量甘油，使用时须注意与RNA样品及水充分混匀，否则可能会导致反转录不充分。
• 42℃孵育10-60min。反转录3kb以下的cDNA，反转录10min即可，反转录3-6kb的cDNA，反转录30min即可，而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。后续用于qPCR时，检测任何长度的基因，通常反转录10min就足够了。
  注意：对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA，可以50℃反转录60min，以充分利用本产品反转录酶在50℃时仍有良好的反转录酶活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
• 80℃孵育10min以失活反转录酶并终止反转录反应。说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚lǜ仿抽提或柱纯化方法。
• 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20μl和50μl，则推荐相应地使用0.8μl和2μl反转录产物。

二、引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。

常见问题分析：
 

• 总RNA反转录产物电泳观察不到。
   
  • 反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
• 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
   
  • PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
  • 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
  • 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用百奥莱博的BalbZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
  • 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
  • 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-55℃。
  • BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液(5X)没有与RNA样品及水充分混匀。

根据您的关注的BalbRT III cDNA第一链合成预混反应液，cDNA第一链合成预混液，您可能还对以下产品有需求：



名称：APCDD1 mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0074
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.APCDD1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
APCDD1的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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货号	名称	规格
YT027	基因定点突变试剂盒	10次
ZN0095	ASIC3 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0265	CDC25C mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0310	Collagen IV mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0508	FGF5 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0556	GADD45 mRNA原位杂交试剂盒	100T

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