SARS-CoV-2新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒

特别提示：包括SARS-CoV-2新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒(N基因，染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：SARS-CoV-2新型冠状病毒荧光定量检测试剂盒(N基因，染料法)
英文名称：SARS-CoV-2 N Gene SYBR RT-qPCR Kit
产品货号：BTN14-81920y
产品规格：50T

本试剂盒是根据染料法RT-qPCR原理开发，用于体外检测人鼻咽拭子、痰液及肺泡灌洗液中的新型冠状病毒的N基因，仅作为应对SARS-CoV-2感染的肺炎疫情期间的体外诊断应急使用。在使用上应遵守《中国CDC新冠肺炎实验室检测技术指南》、《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案》等文件（现行版）的相关要求。可用于科研领域快速检测SARS-CoV-2新型冠状病毒。

试剂盒特点：
1．一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2．根据SARS-CoV-2冠状病毒的N基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3．基于染料法RT-qPCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4．使用一管式RT-qPCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5．本产品足够50次20μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

试剂盒组成：
 

组分	规格
2×RT-qPCR缓冲液	500μL
10×RT-qPCR酶混合液	100μL
ROX染料I，50×	20μL
ROX染料II，50×	20μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR引物混合液	100μL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR阳性对照 (1×108拷贝/μL)	50μL

保存条件：20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。

使用方法：

一、稀释阳性对照（以10²-10⁷这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1．标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
2．在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3．换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4．换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
5．如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
6．用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒。

三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
7．如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
8．在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
 

成分	N+2个制 备所得样品	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR阳性 对照（2-7管）
2×RT-qPCR缓冲液	各10μL	10μL	各10μL
SARS-CoV-2 N基因RT-qPCR引物混合液	各2μL	2μL	各2μL
50×ROX*	各0.4μL	0.4μL	各0.4μL
样品制备所得RNA模板	各5.6μL	-	-
水	-	5.6μL	-
稀释所得6个阳性对照	-	-	各5.6μL
10×RT-qPCR酶混合液	各2μL	2μL	各2μL

*注：
需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用ROX染料II的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。

9．上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。
 

过程	温度	时间
RT（逆转录）	50℃	15-30min
预变性	95℃	10min
RT-PCR反应（40个循环）	95℃	15sec
	60℃	1min
按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理
10．如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于37则为阳性。如果在37-40之间，则重复一次。若重复结果Ct值小于40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

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