SARS-CoV-2 N蛋白基因质粒

特别提示：包括SARS-CoV-2 N蛋白基因质粒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：SARS-CoV-2 N蛋白基因质粒
英文名称：SARS-CoV-2 N gene plasmid
产品货号：YTB3022
产品规格：1μg|100μg

SARS-CoV-2 N基因质粒是我公司推出的哺乳动物细胞表达质粒，用于表达C端带有Myc标签(EQKLISEEDL)的SARS-CoV-2核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)，可以使用抗Myc标签的抗体来识别N蛋白的表达，或进行免疫共沉淀分析等。该质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达，质粒为氨苄青霉素抗性。

N蛋白是冠状病毒的四个结构蛋白之一，由N基因编码，为核衣壳磷酸蛋白，是冠状病毒的主要结构蛋白，也是冠状病毒编码蛋白中表达丰度最高的蛋白。N蛋白在病毒的组装、释放以及病毒的致病性方面发挥重要作用。冠状病毒N蛋白功能相对保守，包含两个结构独立的RNA结合结构域：N端RNA结合结构域(N-terminal RNA binding domain，NTD)和C端结构域(CTD)，中间还有一个丝氨酸和精氨酸富集的连接区(SR linker)。冠状病毒的N蛋白能与病毒RNA紧密结合，通过螺旋堆积将RNA包装，从而保护病毒的基因组RNA。在病毒感染过程中，N蛋白是所有结构蛋白中诱导免疫反应最强烈的蛋白，由于其分子量小，没有糖基化修饰，易于蛋白表达纯化，因此常作为冠状病毒血清学检查最为合适的抗原。

SARS-CoV-2 N基因质粒主要信息如下：
 

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	232-819
T7 promoter and T7 primer binding site	863-882
Multiple cloning site	895-922
N protein	923-2179
Myc-tag	2180-2209
BGH pA	2250-2474
f1 origin of ss-DNA replication	2520-2948
SV40 promoter	2953-3296
Neomycin resistance ORF	3358-4152
SV40 polyA signal	4326-4456
pUC origin	4839-5509
Ampicillin resistance ORF	5654-6650
bla promoter	6549-6555

SARS-CoV-2 N基因质粒图谱如下：


SARS-CoV-2 N基因质粒d的单酶切位点包括：
 

Acc65I	G`GTAC,C	917	NarI	GG`CG,CC	3486
AfeI	AGC|GCT	1852	NheI	G`CTAG,C	895
AflII	C`TTAA,G	908	NruI	TCG|CGA	208
AhdI	GACNN,N`NNGTC	5727	PaeR7I	C`TCGA,G	1122
ApaI	G,GGCC`C	2223	PciI	A`CATG,T	4837
BbvCI	CC`TCA,GC	1677	PflMI	CCAN,NNN`NTGG	1277
BcgI	,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN`	6232	PluTI	G,GCGC`C	3489
BmgBI	CAC|GTC	1751	PspOMI	G`GGCC,C	2219
BmtI	G,CTAG`C	899	PspXI	VC`TCGA,GB	1122
BsaBI	GATNN|NNATC	3345	PvuI	CG,AT`CG	6097
BseRI	GAGGAG(N)8,NN`	3272	RsrII	CG`GWC,CG	4002
BsmI	GAATG,CN`	4406	SacI	G,AGCT`C	818
BssHII	G`CGCG,C	3883	ScaI	AGT|ACT	6207
BstBI	TT`CG,AA	4168	SexAI	A`CCWGG,T	3043
BstXI	CCAN,NNNN`NTGG	1936	SfoI	GGC|GCC	3487
BstZ17I	GTA|TAC	4458	SmaI	CCC|GGG	3299
CspCI	,NN` (N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN`	626	SnaBI	TAC|GTA	590
DraIII	CAC,NNN`GTG	2753	SpeI	A`CTAG,T	249
EagI	C`GGCC,G	3392	SspI	AAT|ATT	6531
Eco53kI	GAG|CTC	816	StuI	AGG|CCT	3275
EcoO109I	RG`GNC,CY	2219	TspMI	C`CCGG,G	3297
EcoRI	G`AATT,C	1200	XbaI	T`CTAG,A	2213
KasI	G`GCGC,C	3485	XcmI	CCANNNN,N`NNNNTGG	1775
KpnI	G,GTAC`C	921	XhoI	C`TCGA,G	1122
MluI	A`CGCG,T	228	XmaI	C`CCGG,G	3297
MscI	TGG|CCA	3568

SARS-CoV-2 N基因质粒推荐使用的测序引物序列如下：
primer (829-848):5"- CTAGAGAACCCACTGCTTAC -3"
primer (2244-2261):5"- TAGAAGGCACAGTCGAGG -3"

SARS-CoV-2 N基因质粒转染HEK293T细胞后的表达效果请参考下图：

Western blot实验检测SARS-CoV-2 N基因在HEK293T细胞的表达。
1.转染空载质粒；
2.转染SARS-CoV-2-N基因质粒。
使用我公司的LP8000转染试剂(YTB3200)将2μg空载质粒或SARS-CoV-2 N基因质粒转染六孔板中密度为80%左右的HEK293T细胞，37℃恒温培养48h后，弃掉孔内培养液，PBS洗涤三遍后加入150μL Western及IP细胞裂解液(YT038)充分裂解，4℃离心，取上清用BCA法测蛋白浓度，然后经浓度4-20%的预制胶电泳，每孔蛋白总量20μg，转膜、封闭后使用1:1000稀释的Myc抗体(YT824)室温孵育1h，洗涤后1:1000稀释的二抗室温孵育1h，最后经BalbECL Star(YT061)化学发光，并使用化学发光成像系统拍照记录。

使用说明：
1．首次使用1μg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2．100μg包装的本产品质粒浓度为0.1μg/μl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。

根据您的关注的SARS-CoV-2 N蛋白基因质粒，新型冠状病毒N蛋白表达基因质粒，SARS-CoV-2-N质粒，SARS-CoV-2 N基因质粒，新冠病毒N基因质粒，新冠病毒N蛋白表达基因质粒，您可能还对以下产品有需求：


BTN130805 单细胞悬浮液 1mL
BTN60803 可保种型蓝白T载体 50 ng
BTN140430 大肠杆菌OmniMAX2-T1 Phage Resistant化学感受态细胞 0.1mL*10
BTN80701 大肠杆菌TG1化学感受态细胞 0.1mL*10
BTN90504 大肠杆菌XL1-Blue化学感受态细胞 0.1mL*10
BTN161205 农杆菌EHA101感受态细胞 10×100μL
BTN120699 多粘菌素B硫酸盐 5mL
YT458 TNF-α启动子荧光素酶报告基因质粒 1μg

关注SARS-CoV-2 N蛋白基因质粒，新型冠状病毒N蛋白表达基因质粒，SARS-CoV-2-N质粒，SARS-CoV-2 N基因质粒，新冠病毒N基因质粒，新冠病毒N蛋白表达基因质粒的同时，为您推荐更多您可能感兴趣的产品：



名称：pUCm-T载体
货号：BTN160101
规格：1μg
本产品是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC系列载体改造而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3′端形成悬挂的“T”末端。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA 每条链的3′端加上一个突出的碱基A。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到，pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片断的重组克隆，大大提高了3′末端A 突出PCR产物的连接、克隆效率。本产品应用于进行TA 克隆，克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物可以用M13通用引物进行DNA 测序。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 实验准备
1. PCR产物3′末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物3′末端均带有突出的A碱基。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验。
2. PCR产物3′末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3′A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3′末端加A，再进行连接转化实验。

二.连接反应
3.在一个标准的10mL连接反应体系中，加入下列成分：
 

反应组分	10μl反应体系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本产品	1μL(50 ng)
10×连接酶缓冲液	1μL
T4 DNA连接酶	3-5 U
补水到	10 L

 注意:一般最后加入T4 DNA连接酶。
4. 用移液器吹打反应混合液使之混匀后，16-23℃连接1～12小时(或按T4 DNA连接酶供货商提供的操作手册进行连接)。

三．细菌转化和鉴定
5. 将100μl感受态细胞置于冰上解冻后，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
6. 加入上述5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟。
7. 42℃水浴热激90秒，再冰上放置15～20分钟。
8. 加入400μl自备的SOC培养基，37℃ 200～250rpm振荡培养1小时。
9. 4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
10. 将细菌悬液均匀涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的氨苄青霉素抗性的自备的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。)
11. 将平板于37℃培养1小时，然后倒置培养过夜。(先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体。)

四．筛选
12.转化子的蓝白筛选：
 当外源DNA片段插入到pUCm-T载体中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重组克隆在-gal/IPTG 平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。选择在IPTG/X-gal 平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。
13.转化子的鉴定：
1)用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，用PstI单酶切或用其它合适的酶切,琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合适的引物直接进行测序来确定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR产物的纯度：
 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
2. 平端PCR产物
 具有校正活性的热稳定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR产物可以进行3′末端加A 尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
3.优化插入片段和载体的摩尔比
1)pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
2)PCR产物的量可采用以下公式进行换算：
PCR片段的量(ng)= [加入载体的量(ng)×插入片段大小(kb)/载体大小(kb)]×插入片段和载体的摩尔比
4.筛选含插入片段的转化子
插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β-半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍(含3′-A)，并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。

质粒图谱：

北京百奥莱博科技有限公司一家专注于生命科学研究领域的生物技术公司，坚持“质量至上，服务为本，全心全意助力生命科学”的理念，为广大用于提供稳定、可靠、专业的产品和服务支持，产品线包括分子生物学，细胞生物学，免疫检测，抗体，重组蛋白，血液制品等系列。“忙忙碌碌的平凡，铸就事业的不凡”。让我们携起手来，共同创造生命科学的蓬勃发展。