通用型LAMP试剂盒(双染料)

特别提示：包括通用型LAMP试剂盒(双染料)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：通用型LAMP试剂盒(双染料)
英文名称：Fluorescent and Visual LAMP Kit
产品货号：BTN200601
产品规格：50次

通用型双染料LAMP试剂盒是基于双染料LAMP技术推出的荧光和可见光双模式LAMP扩增及检测试剂盒，它既可以用于荧光LAMP扩增及检测，也可以用于可视化LAMP扩增及检测，适用于各种针对核酸的快速定性检测。

试剂盒特点：
1．一般60分钟内出结果（取决于靶分子浓度），比PCR快约1小时。
2．对20μL的反应体系，最大样品加样量达到14μL。
3．含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
4．内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
5．特异性比PCR高，因为LAMP扩增使用4-6条引物而不是两条。
6．灵敏性可达10拷贝/反应以下（随引物而不同），故假阴性率更低。
7．只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
8．本产品只适用于LAMP检测，不适用于进行RT-LAMP检测。
9．本产品足够50次20μL体系的荧光及可视化LAMP扩增。

试剂盒组成：
 

组分	规格
4×LAMP MagicMix	250μL（绿盖）
4×阳性对照及引物	50μL（黄盖）

保存：-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂：
LAMP模板及LAMP引物、PCR级石蜡油（仅对使用金属浴或水浴者）。

使用方法：

准备工作：
如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。本公司发现很多水浴锅或金属浴温度不准，故建议先用阳性对照和阴性对照测试所用仪器在60℃、62.5℃、65℃、67.5℃和70℃五个温度下扩增效果，选择阳性和阴性颜色差异最大的温度进行扩增。

一、样品DNA的制备
1．用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，可以选购我公司的各种免提取试剂盒，根据样本不同选择不同货号的产品。
2．如果有N个样品，则至少需要做N+2个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后N+2个样品一起进行DNA提取操作，得到N+2个DNA样品。

二、配制并测试自备的20×LAMP引物混合液
3．用超纯水将自备的6种（或4种）LAMP引物干粉稀释到母液浓度（100μM），然后按下表配制100μL的20×LAMP引物混合液，此混合液足够100次20μL体系的LAMP扩增。如果需要配制的20×LAMP引物混合液体积异于100μL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
 

引物名称	母液浓度	加母液量	在20×LAMP引物 混合液中的浓度
FIP引物	100μM	32μL	32μM
BIP引物	100μM	32μL	32μM
F3引物	100μM	4μL	4μM
B3引物	100μM	4μL	4μM
Loop F	100μM	8μL	8μM
Loop B	100μM	8μL	8μM
超纯水	-	12μL	-

注意：总体积为100μL。如果自备的LAMP引物不含Loop引物，则按上表配制时Loop用超纯水替代，使得总体积为100μL。
4．测试引物的非特异扩增：在加模板和不加模板（至少1000拷贝/反应）的LAMP系统中测试引物效果，引物选择标准可以自己掌握，最好选择无模板反应的Ct值比有模板反应的Ct值大60以上（每个循环1分钟）的引物对。根据结果设定判断阴性和阳性结果的阈值（本产品只用于定性）。
如果没有qPCR仪器，只能用肉眼检测，则无需设定阈值，届时靠跟阳性对照和阴性对照管的颜色来判断。

三、LAMP扩增（20μL体系）
5．反应设置：如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+5个LAMP扩增，增加扩增阳性对照、无模板对照和无引物对照各1个。在N+5个0.2mL的PCR管中加入下列成分：
 

成分	N+2个 样品管	无模板 对照管	无引物 对照管	扩增 阳性对照管
4×LAMP MagicMix	各5μL	5μL	5μL	5μL
自备20×引物混合液	各1μL	-	1μL	-
自备N+2个样品DNA	最多14μL	同样品管	-	-
4×阳性对照及引物	-	-	-	5μL
超纯水	补到20μL	补到20μL	14μL	10μL

6．混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列两种方式进行扩增和检测。
7．如果使用金属浴、水浴或普通PCR仪，如果没有热盖，则必须先在每个反应管中加30μL石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率和颜色显示。65℃保温120分钟。
8．如果使用荧光定量PCR仪：聚合温度设为65℃，1次循环1分钟，120个循环，每分钟在FAM通道采集一次荧光信号。

四、结果分析及解读
9．所有阳性对照有阳性结果（Ct在阈值内或反应液呈蓝色），所有阴性对照有阴性结果（Ct大于阈值或反应液呈淡蓝色），否则提取实验或扩增实验无效。需要寻找原因或跟厂家联系，暂时不需要分析样品的结果。
10．如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。如果肉眼观察，样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增有靶分子，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增无靶分子。反应结果示例如下（9为阴性，10为阳性）：

11．如果是用荧光PCR仪，样品Ct将小于阈值则为阳性，大于阈值则为阴性。
12．当实时荧光检测和可视化检测同时使用时，如果不一致，以实时荧光LAMP的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果20-30分钟，也就是说，在qPCR仪上第30分钟时呈现阳性的样品，其颜色变化在第50-60分钟时才能观察到。

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名称：Pfu DNA聚合酶(Pfu酶)
货号：YT372
规格：200U|1000U
pfu DNA聚合酶简称Pfu酶，是最常用的高保真DNA聚合酶之一。Pfu DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Pyrococcus furiosus的高度热稳定的DNA聚合酶。Pfu酶的分子量为90kDa。Pfu酶可以催化5’至3’方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合。和Taq酶不同，Pfu酶有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)。另外，Pfu酶有5’至3’外切酶活性，但Pfu酶没有反转录酶活性。

由于Pfu酶有3’至5’的外切酶活性，因此在PCR扩增过程中出错的几率大大降低，出错率为2.6×10e-6。Pfu的出错率不仅远远低于Taq酶，也低于一些其它的高保真DNA聚合酶例如Vent、DeepVent、Pwo、Tli等，因此Pfu酶常作为首选的高性价比的高保真DNA聚合酶。

来源：本Pfu DNA Polymerase为recombinant Pfu DNA Polymerase，通过大肠杆菌表达纯化获得，和纯化获得的天然Pfu DNA Polymerase在各方面的性质相同。

用途：高保真PCR (high fidelity PCR)、点突变、双平端PCR克隆等。
1）Pfu酶扩增出来的DNA片断为双平端，可以用于双平端克隆，但不能用于常规的T载体克隆。
2）dUTP和dITP或含有dUTP和dITP的引物不能用于Pfu酶介导的PCR扩增反应。

活性定义：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10nmol of deoxyribonucleotides into a
polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30min at 72℃.Enzyme activity is assayed in the following mixture:20mM Tris-HCl (pH8.8 at 25℃),2mM MgSO4,10mM (NH4)2SO4,10mM KCl,0.1% (v/v) Triton X-100,0.1mg/ml BSA,0.75mM activated calf thymus DNA,0.2mM of each dNTP,0.4 MBq/ml [3H]-dTTP.

纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规PCR反应要求。

酶储存溶液：20mM Tris-HCl (pH8.2),1mM DTT,0.1mM EDTA,100mM KCl,0.1% (v/v) Nonidet P40,0.1% (v/v) Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。

10×Pfu Buffer (with Mg2+)：200mM Tris-HCl (pH8.8 at 25℃),100mM (NH4)2SO4,20mM MgSO4,100mM KCl,1% (v/v) Triton X-100,1mg/ml BSA。

失活或抑制：酚氯fǎng抽提可以使Pfu酶失活。

储存条件：-20℃。

注意事项：
1）由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍，在使用Pfu酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
2）Pfu DNA polymerase在扩增DNA片断时的出错率非常低，但其扩增效率也比较低。对于出错率要求不高的情况，例如RT-PCR进行定量或半定量，推荐使用Taq DNA polymerase。在扩增效率和出错率需要兼顾的情况，可以选择YTTaq DNA polymerase。在扩增2kb以下DNA片断时，Pfu酶和Taq酶的扩增效率相近。在准确性要求很高的情况下，须选择Pfu酶。
3）Pfu酶有3’至5’的外切酶活性，在没有dNTP的情况下可以降解引物。因此Pfu酶一定要最后加入，并且要在冰浴上操作。
4）不能使用Taq酶的PCR Buffer来替代Pfu酶的PCR Buffer。

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