登革热NS1抗原检测试剂盒（酶联免疫法）

 
【预期用途】
此试剂盒用于登革热病毒的早期检测，通过酶免分析法定性检测人血清中的NS1抗原。它可以在IgG和IgM抗体出现之前对人血清中的登革热病毒的进行早期诊断。此试剂盒不能用于筛查血液或血液成分，仅用于研究。
 
【前言简介】
登革热是一种急性病毒性疾病，它主要通过埃及伊蚊传播。登革热在临床上主要表现为：双相热、皮疹和造血抑制，还可表现出全身症状，如浑身不舒服、关节痛、肌肉疼痛和头痛，有时还可能出现极为罕见的出血性高烧，并可能导致致命性的休克。登革热主要流行于热带和亚热带地区，大概每年会发生100,000,000例。据统计，每年大概会出现500到1000万例登革热病人，同时还会出现250000到500000例登革热出血热。在2002年，据报道，30多个拉丁美洲的国家出现10000000例登革热病人，并且大多数是登革热出血热（DHF）病人。之后在2003年到2005年，在印度的一些地方也广泛流行DHF。在美国，据报道，DHF病人在1996到2002年就增加了三倍。据报道说，登革热也在夏威夷和德克萨斯州的拉雷多爆发过。由于病毒的潜在传染性，一些病毒包括登革热都被列为CDD的A类潜在传染原。登革热NS1（非结构蛋白）蛋白是一个六聚体分泌的蛋白。它是病毒RNA复制中重要的角色，它强烈的免疫原性引起抗体和补体的活性。在急性感染血液中可检测到NS1抗原。此试剂盒可检测即时感染患者血清中的NS1抗原。
 
【实验原理】
此试剂盒具有高灵敏度，快速和可靠性分析，采用夹心法检测血清中低含量的NS1。
质控和未知血清样品用样品稀释缓冲液稀释。微孔中包被高效的NS1抗体，封闭，样品中的NS1抗原被捕获，与二抗形成夹心。通过辣根过氧化物酶和TMB底物显色液产生的颜色反应来判断NS1抗原，用酸溶液终止反应，然后用酶标仪在450nm处读取吸收值。阴性和阳性血清测得的值作为样品中NS1抗原的诊断依据。
 
【试剂盒组成】

1. 微孔板：      12×8，96孔。
2. 阴性质控：    1x300ul，含有沉淀物的话使用前应离心。
3. 阳性质控：    1x300ul，含有沉淀物的话使用前应离心。
4. 临界质控：    1x300ul，检测临界值，含有沉淀物的话使用前应离心。
5. 样品稀释液：  1x15ml，含有二抗，Proclin（0.02-0.03%）作为防腐剂。
6. 酶联物：      1x150ul,100X，含有辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体，使用前混匀。
7. 酶联物稀释液：1x12ml,用于100X酶联液的稀释，直接将酶联物加入此溶液即得到100X的酶连液，配制液在2-8℃下可保存2周。未开封的稀释液2-8℃下保存至有效期。
8. 洗涤缓冲液：  1x120ml，10X浓缩。
9. 底物液：      1x12ml，含TMB。
10. 终止液：      1x6ml，室温下保存至有效期。

实验所需材料但试剂盒未提供

1. 酶标仪
2. 去离子水或双蒸水
3. 真空泵
4. 37℃孵箱
5. 1-10ul的单通道移液器，50-200ul单通道和多通道的移液器
6. 聚丙烯试管或96孔稀释板
7. 保鲜膜
8. 计时器
9. 混合器

 
【样品采集和准备】

1. 此试验只能使用人血清，由于试剂未得到优化，所以不能直接用于全血或血浆的检测。
2. 从红细胞凝块中提取出血清，不能使用溶血。
3. 样品采集后应尽快进行实验，不要将血清长时间放置在室温下。
4. 采取静脉穿刺采血，样品在2-8℃下可保存7天，-20℃或更低温度可保存30天，想要保存更长时间，应贮存在-70℃，避免反复冻融。
5. 使用前应将冻存的样品在室温下溶解。
6. 如果血清是需运输的，则需根据联邦感染试剂运输法规进行包装运输。

 
【实验步骤】
所有试剂在使用前都应平衡至室温，混匀。
试剂准备：

1. 1X洗涤缓冲液：120ml的10X的洗涤缓冲液和1080ml的去离子水混合。充分混匀，确保完全溶解。1X的洗涤缓冲液在室温下可保存6个月，使用前应检查其是否被污染，被污染的则应丢弃。
2. 微孔板：固定实验所需的微孔条，不用的应保存在密封袋内，贮存在2-8℃下至有效期。
3. 酶连液的制备：120uL的100X的酶联物直接加入到12ml的酶联稀释液瓶中，充分混匀，2-8℃下可保存2周，2周后应将其丢弃，不能再用于试验。

操作步骤：

1. 阳性、阴性和临界质控设置平行样，未知样品可不设置，90个试验样品可在一块板上进行检测。
2. 吸取50ul的样品稀释液至相应的孔内。
3. 在含有样品稀释液的孔内加入50ul的未稀释血清，混匀。
4. 盖板，37℃下孵育1h。
5. 每孔加入300ul的1X洗涤液，全自动洗板机洗板6次。
6. 用多通道移液器每孔加入100ul的酶联物，丢弃剩余的酶联物或者是保存在2-8℃下至2周。
7. 盖板，37℃下孵育30min。
8. 全自动洗板机洗板6次。
9. 每孔加入100ul的TMB底物液。
10. 黑暗处，室温下孵育20min。
11. 每孔加入50ul的终止液，不盖板，室温下放置1min。
12. 酶标仪450nm处读取数据。

 
【结果计算】
未知样品的结果计算，先计算试验临界值，紧接计算样品OD值与临界值之比
 
临界值的计算：计算临界质控样品的OD均值
如OD                   
NO1           0.152   
NO2           0.189   
总计              0.341
临界质控平均值=0.341÷2=0.171
ISR的计算：计算样品OD值/临界值，计算每个样品的ISR
如：样品OD值=0.431
样品的ISR=样品OD值÷临界值
样品ISR=0.431÷0.171=2.52

样品状态	ISR
阳性样品	≥1
阴性样品	＜1

 
临界值的计算：
流行质控血清不能用于临界值的计算，建议用地方性相关人群的血清进行临界核实。
 
结果说明：OD值≥临界（ISR≥1）认为是阳性，含有NS1抗原。OD值接近临界值的（1.1＞ISR＞0.9）应重复做一次再来确定。
 
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
 
仅供科研使用
 
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