血友病模型

血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。南模可提供F8与F9基因敲除小鼠模型。

血友病A是由凝血因子VIII（FVIII）缺乏和(或)其功能障碍所引起的X连锁隐性遗传性出血病。人的FVIII基因位于X染色体上，全长186kb，由26个外显子组成。临床研究表明，血友病A主要是由于FVIII基因的点突变、基因倒置、小段基因的缺失和插入造成的。

南模生物自主研发的FVIII基因敲除小鼠是在小鼠胚胎干细胞（SCR012，来源于129S6/SVEV）上以同源重组方式造成内源FVIII基因序列部分缺失（16~19外显子），进而通过四倍体补偿技术获得完全胚胎干细胞来源的FVIII基因敲除小鼠，该小鼠进一步与C57 BL/6J小鼠交配育种，品系名称：B6.129-F8tm1Smoc，品系编号：NM-KO-00012

经实验证实FVIII基因敲除小鼠具有典型的血友病A表型：

• 在进行小鼠剪尾和脚趾编号时，若不给予及时的止血处理，雄性杂合子小鼠和雌性纯合子小鼠会因大量失血而死亡。

• FVIII活性检测显示（Fig5），雄性杂合子（-/y）和雌性纯合子（-/-）小鼠的FVIII的活性仅为野生型（wt）小鼠的8%和10%，而雌性杂合子小鼠的活性为野生型小鼠的80%。

• 激活的部分凝血活酶时间（APTT）检测显示（Fig6），雌性杂合子小鼠的APTT时间比野生型小鼠的略有延长，而雄性杂合子（-/y）和雌性纯合子（-/-）小鼠的APTT值均大于120秒。

Fig1. FVIII基因敲除小鼠构建策略示意图

Fig2. FVIII基因敲除小鼠基因型鉴定PCR结果

Fig3. FVIII基因敲除小鼠FVIII mRNA表达水平检测结果

Fig4. FVIII基因敲除小鼠免疫组化染色结果

Fig5. FVIII基因敲除小鼠FVIII活性检测

Fig6. FVIII基因敲除小鼠APTT检测

FVIII基因敲除小鼠是在整体动物水平研究血友病A发病机制和药物筛选的理想动物模型，可以为血友病A治疗药物的筛选和评价、血友病A的基因治疗等研究提供理想的动物模型和新的实验手段。为进一步阐述疾病发生机制、疾病防治药物的评价筛选和新疗法的研发提供了有效工具。

F9基因敲除小鼠模型

血友病B是由凝血因子IX（FIX）缺乏和(或)其功能障碍所引起的X连锁隐性遗传性出血病。人的FIX基因位于X染色体上，全长31kb，由8个外显子组成。通过CRISPR/Cas9技术介导的非同源重组修复，造成蛋白翻译移码突变并提前终止。

Fig7 F9构建策略图。

Fig8 F9 mRNA在WT和KO小鼠品系肝组织中的表达。

Fig9 WT和KO小鼠品系血浆中FIX蛋白的浓度。

Data in c and d were acquired from 8 mice per group, and are shown as the mean ± the s.d.

Twotailed unpaired Student’s t tests were used to determine the P value.**P < 0.01