SARS-CoV-2 RT-LAMP试剂盒(Orf1ab-N片段)

特别提示：包括SARS-CoV-2 RT-LAMP试剂盒(Orf1ab-N片段)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：SARS-CoV-2 RT-LAMP试剂盒(Orf1ab-N片段)
英文名称：SARS-CoV-2 Orf1ab-N Visual RT-LAMP Kit
产品货号：BTN16-81930
产品规格：50次

本试剂盒基于环介导等温扩增（LAMP）技术，专门用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的Orf1ab-N片段。

试剂盒特点：
1．即开即用，用户只需要提供样品RNA。
2．用RT-LAMP恒温扩增法扩增新冠病毒Orf1ab-N片段，不需要荧光PCR等贵重仪器。
3．所用酶具有RT和LAMP活性，两步反应一步完成，扩增时间最多1h，尤其适合现场或实验条件简陋的单位使用。
4．检测灵敏性比PCR高10倍以上。
5．特异性高，由于使用四条针对Orf1ab-N片段的特异引物，比使用2条引物的PCR专一性更高。
6．提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
7．最低灵敏度在100拷贝/反应左右。
8．本试剂盒足够做50次20μL体系的RT-LAMP扩增。
9．本产品只能用于科研。

试剂盒组成：

组分	规格
2×Visual LAMP MagicMix	500μL
SARS-CoV-2 Orf1ab-N片段RT-LAMP引物混合液	200μL
SARS-CoV-2 Orf1ab-N片段RT-LAMP阳性对照 (1×107拷贝/μL)	50μL

保存条件：-20℃保存，保存期限为一年。新冠病毒Orf1ab-N片段RT-LAMP阳性对照最好单独放置，不要污染其他试剂。

使用方法：

一、样品RNA的制备
1．用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容，可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒(BTN71001)。
2．如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。样品使用量根据所选择的试剂盒决定。新冠病毒Orf1ab-N片段RT-LAMP阳性对照的1000倍稀释液作为样品制备阳性对照，样品制备阴性对照是直接用X mL水作为阴性对照，然后和N个样品一起进行RNA提取操作，得到N+2个RNA样品。

二、RT-LAMP（20μL体系）
3．反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP阴性对照和阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：

成分	N+2个 样品管	RT-LAMP 阴性对照管	RT-LAMP 阳性对照管
2×Visual LAMP MagicMix	各10μL	10μL	10μL
SARS-CoV-2 Orf1ab-N片段 RT-LAMP引物混合液	各4μL	4μL	4μL
N+2个样品RNA	各6μL	-	-
水	-	6μL	-
SARS-CoV-2 Orf1ab-N片段 RT-LAMP阳性对照的1000倍稀释液	-	-	6μL

4．混匀，此时反应液呈现非常浅的蓝色，由于是否有反应是跟阴性对照和反应前对比，所以一定要设置阴性对照，并且反应前要手机照相留存以供反应后比对。
5．61℃扩增60min。如果是在PCR仪中保温，必须加热盖。如果用金属浴保温，没有热盖，必须在孔中加水以填充孔和管子间的空隙，并在管中加50μL石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率）。
6．80℃10min灭活Bst聚合酶和UNG酶。
7．将反应管放置在白色背景（如白纸）前观察，观察反应液颜色并用手机照相留底。

三、实验结果分析
8．阳性对照将呈现蓝色，无模板的阴性对照将呈现无色或非常浅的蓝色，样品管的颜色如果接近阳性对照则说明有扩增，如果接近阴性对照则说明无扩增。标准的反应结果如下图（9号为阴性，10号为阳性，此处的9号和10号跟下步的电泳照片中的9号和10号是相同的两个样品）：

9．对不好判断的样品，可以电泳确认实验结果：取10μL RT-LAMP扩增产物直接进行2%琼脂糖凝胶电泳（本产品不需要单独加Loading Buffer），最好使用100 bp DNA Marker。如果样品为阳性，将会得到梯形扩增产物。典型的电泳结果见下图（奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果。此处的9号和10号跟上步照片中的9号和10号是相同的两个样品）。

10．注意消除环境污染，RT-LAMP产物易产生气溶胶，飘在空气中影响下一次实验，建议反应结束后，用紫外灭菌。先加好除阳性对照和样品以外的其它溶液，到另一个房间添加阳性对照及样品，可有效防止引物、MagicMix被污染。

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名称：禽传染性喉气管炎病毒单重荧光PCR检测试剂盒
货号：SYA773
规格：48次/盒
一、简介：
本试剂盒用一对禽传染性喉气管炎病毒特异性引物，结合一条特异性探针，用一步法荧光RT-PCR技术对禽传染性喉气管炎病毒RNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断

二、用途：
该试剂盒适合于检测气管渗出物、支气管和肺组织、肾脏或输卵管等标本中禽传染性喉气管炎病毒(AILT)RNA，用于禽传染性喉气管炎病毒(AILT)感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考

三、试剂盒组成：(48T)
组份 数量 规格
禽传染性喉气管炎荧光qRT-PCR反应液(AILT-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(AILT-PTC) 1管 50μL/管

四、储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入无菌的干燥玻璃管，室温(22-25℃)放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二钠)或柠檬酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5mL灭菌离心管。
6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500µL PBS或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无RNA酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。
6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨(最好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。
6.2 RNA提取
可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的RNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤：
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(AILT-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1µL N×1µL
总量 15µL N×15µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(AILT-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qRT-PCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃ 延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX 参比荧光。

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
（1） 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
（2） 阳性对照(AILT-PTC)：均产生扩增曲线。
（3） 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明AILT核酸阳性。
（2） Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明AILT核酸阴性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行AILT qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明AILT核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
（1） 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
（2） 所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。
（3） PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
（4） 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
（5） 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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