SNP 检测分型试剂盒for KASP

ASP 2x PCR Mix 说明书

• 试剂盒货号

货号：SNP分型	产品名称
#GBS-1016-001-1	KASP  2X  PCR mix 96/384, 250x10ul reactions (1.25ml)
#GBS-1016-011-1	KASP  2X  PCR mix 96/384, 250x10ul reactions (1.25ml)，sto ROX
GBS-1016-001	KASP  2X  PCR mix 96/384, 500x10ul reactions (2.5ml)
GBS-1016-011	KASP  2X  PCR mix 96/384, 500x10ul reactions (2.5ml)，sto ROX
GBS-1016-002	KASP  2X  PCR mix 96/384, 5,000x10ul reactions (25ml)
GBS-1016-012	KASP  2X  PCR mix 96/384, 5,000x10ul reactions (25ml)，sto ROX
#GBS-1016-111-1	KASP  2X  PCR mix 96/384/1536,1250x2ul reactions (1.25ml)，sto ROX
GBS-1016-112	KASP  2X  PCR mix 96/384/1536, 25,000x2ul  reactions (25ml)，sto ROX
GBS-1016-113	KASP  2X  PCR mix 96/384/1536, 250,000x2ul reactions (250ml)，sto ROX

 

• KASP基因分型原理

Kompetitive Allele-Specific PCR(KASP)这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)。
实验流程主要包括：
  • 准备：1）两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的Primer Mix，两条正向引物5’端分别连有不同序列的检测引物序列；2）带有不同荧光的两条检测引物PCR  Mix；3）DNA 模板
  • PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；
  • PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；
  • PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。
注意事项

• 为提高分型成功率，上游分型引物终浓度应≤300nM；推荐浓度为100~200nM；
• 试剂盒-20 °C避光保存。避免长期放置于4°C 或室温条件下。
• 轻柔颠倒离心管数次以使试剂混合均匀，避免产生泡沫，短暂离心后备用。
• 尽量使用无菌的蒸馏水。

 

• 实验步骤

• 解冻并轻柔混匀试剂盒中的PCR Mix。短暂离心使管中试剂集中于底部，冰上保存。
• 按照下表内容，在冰上准备 PCR反应液。

添加组分	加量（2μl 体系）	加量（10μl 体系）
DNA Template	5 ng – 50 ng	25 ng – 250 ng
KASP 2x PCR Mix	1 μl	5 μl
上游分型引物F1（10μM）	0.02 μL	0.1 μL
上游分型引物F2（10μM）	0.02 μL	0.1 μL
下游通用引物R（10μM）	0.06 μL	0.3 μL
	补水至2μL	补水至10 μL

• PCR反应条件

step 1	预变性	95℃	3 min	1 循环
step 2	降落PCR	95℃	15s	9 循环
		63.4→57℃,-0.8℃/循环	45 s
step 3	扩增	95℃	15 s	28循环
		57.5℃	45 s
step 4	读板	30℃	30 s （read）	1 循环

备注：

• 如26个循环后，发现NTC（用纯净水进行扩增的阴性对照）信号过高，与其他分型掺杂，下次扩增循环数调整为23；
• 如26个循环后，发现所有信号区分不开，则将PCR产物用step 3的程序继续扩增5个循环后，再扫描荧光。

• FAQ

建议的PCR反应体系是怎样的？
96和384孔板，10µL 体系，其中2µl DNA（DNA浓度25~50ng/ul）， 5µL mix, 0.5 µL引物，补水至10ul。
384孔板，5µL体系，其中1µl DNA （DNA浓度25~50ng/ul）， 2.5 µL mix, 0.25µL引物，补水至5ul。
KASP技术对DNA的要求？
建议最小的DNA浓度不低于5 ng / µL。
不同基因组大小所需的DNA的量为：待测样品基因组/3000Mb*5ng。
建议设置DNA浓度梯度实验，来确定最合适的DNA浓度。
粗提的DNA即可满足实验需求，请尽量保证DNA浓度的一致性, 
提取DNA尽量不要用到EDTA。如有EDTA，建议将DNA稀释一下，做一下浓度梯度实验或加MgCl₂优化。
 
多个引物可以同时跑在同一块板子上吗？
可以，但KASP技术要求每个引物至少跑18个样品加两个NTC，否则可能影响分群判读，造成较大的误差
 
KASP试剂的储存条件及建议是什么？
KASP 引物可在4度保存最长至1个月，更长时间的存放建议储存在-20度以下； KASP 2x PCR Mix用完后尽量马上放置-20度以下避光保存，冻融尽量不要超过5次！
 
 
 
 

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