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Bio-Rad 微滴式数字PCR 新型冠状病毒检测方案
2019年12月底在武汉发现的新型冠状病毒肺炎已传播至国内13个省（区、市），截止2020年1月22日，累计报告新型冠状病毒感染的肺炎确诊病例549例，疑似137例，报告死亡病例累计17例。国外也陆续出现确诊病例的报道。
世界卫生组织已正式将造成此次疫情的新型冠状病毒命名为2019 新型冠状病毒( 2019-nCoV )，并发布了针对疑似新型冠状病毒感染造成严重急性呼吸道感染的临床管理临时指导意见。2019-nCoV是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。目前新型冠状病毒传染源尚未找到。
Bio-Rad微滴式数字PCR技术（ddPCR）是第三代PCR技术，无需标准参照物质即可给出样本的拷贝数浓度而非Ct值，其检测结果为判读提供量化的依据。根据LOB(limit of blank)和未知样本的定量结果作出判读，可避免人为错误，缩小灰区，提高检出率。
ddPCR独有的微滴处理技术，使其对PCR扩增效率的变化不再敏感，不惧含有PCR抑制物样本的挑战。随着疫情的变化以及流行病学调研的推进，更多类型的检测乃至环境监测也可能需要进行，ddPCR的这一优势会发挥作用。此外，如果新型冠状病毒发生变异，病毒基因序列上引物、探针靶向位置出现SNV，ddPCR亦能克服引物、探针结合能力下降带来的扩增效率变化，确保稳定检出。不仅如此，还能根据样本微滴荧光信号的变化，发现引物探针靶标区域可能出现变异的病例，为NGS测序分析病毒变异提供样本，助力流行病学研究。
应用如下
2019- nCoV病毒检测方法
疑似病人的快速取样和检测是防止疫情扩散的当务之急。目前新型冠状病毒的诊断，是在符合疑似病例标准的基础上，对痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等样本进行荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框1ab（open reading frame, ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针序列：
Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'
在荧光定量PCR上的结果判断：
阴性:无Ct值或Ct为40；
阳性：Ct值<37，可报告为阳性；
可疑：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。
数字PCR实验，建议采用官方机构推荐的引物、探针序列，结合Bio-Rad ddPCR RNA一步法预混液，经优化反应条件后使用。实验步骤如下图：
部分参考文献
参考文献1：
D Zhou., Y Li., J Li., J Yu., H Yang et.al; Construction of Lentivirus-Based Reference Material for RT-PCR Detection of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus and Its Application in External Quality Assessment. J Nanosci Nanotechnol. 2019 Sep 1;19(9):5510-5516. doi: 10.1166/jnn.2019.16591.
内容简述：
自2012年首次检测到中东呼吸系统综合症冠状病毒（MERS-CoV）以来，核酸扩增技术（NAT）一直是用于快速检测MERS-CoV的最常用的技术。开发稳定、安全的阳性标准品以评估核酸扩增检测的可靠性，并在不同的实验室中执行外部质量评估（EQA）有重要的意义。在这项研究中，MERS-CoV RNA片段包括upE，ORF1b和N被包装在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）颗粒中。利用ddPCR方法，发现冻干的病毒样颗粒（VLP）核酸在37°C或更低温度下稳定，不仅可以安全地用作PCR检测MERS-CoV的对照材料，而且还可以用作EQA的参考材料。在中国宁波国际旅行医疗中心组织的一次EQA中，有49家参与机构在使用各种商业诊断试剂盒和不同提取方法检测MERS-CoV时，虽然有相对一致的结果，但同一样品在不同实验室报告的Ct值不同，这意味着需要对实验室之间的RNA提取方法和/或PCR检测条件进行标准化。
结论：
QX200可用于阳性标准品的标定，且可获得比qPCR更一致的结果。在实际工作中，可以解决没有阳性对照的情况下的检测结果准确性问题。
借鉴意义：
ddPCR可以不依赖于标准品实现绝对定量，结果可靠，还可以用于不同试剂盒之间的性能比较、验证。
参考文献2：
Patterson B., Morrow C., Singh V., Moosa A., Gqada M.,et.al; Detection of Mycobacterium tuberculosis bacilli in bio-aerosols from untreated TB patients. Version 2. Gates Open Res. 2018. doi: 10.12688/gatesopenres.12758.2.
内容简述：
结核病（TB）主要是空气传播的疾病。但是对包含病原菌结核分枝杆菌（Mtb）的生物气溶胶进行定量和定性分析非常具有挑战性。本文目的是从新诊断的结核病患者中采样生物气溶胶，以检测和计数结核杆菌。方法：在定制的呼吸气雾采样室（RASC）中，在1小时内对35例新诊断出痰阳性的TB患者进行了监测。RASC（1.4m的小型洁净室）结合了空气动力学粒径检测，实时CO 2监测以及咳嗽声音记录。利用微滴式数字PCR（ddPCR）可以检测每个生物气溶胶收集装置中的Mtb。
结论：
使用RASC在大多数未经治疗的TB患者呼出的生物气雾剂中鉴定出Mtb。ddPCR检测比固体培养基上的分枝杆菌培养法更为灵敏。
借鉴意义：
在高铁，车站，飞机等人员密集区进行环境采集样品如空气颗粒、水样的监测，ddPCR有更高的灵敏度。
参考文献3：
Persaud, D., Gay, H., Ziemniak, C., Chen, Y. H., Piatak, M., Jr., Chun, T. W., Luzuriaga, K. (2013). Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant. N Engl J Med, 369(19), 1828-1835. doi: 10.1056/NEJMoa1302976
内容简述：
该文是2013年新英格兰杂志发表的使用Bio-Rad ddPCR对HIV检测的文献，主要是对婴儿在出生后30小时开始接抗逆转录病毒治疗，并持续监测其体内HIV病毒含量的应用，ddPCR的检测灵敏度达到LOD <3 拷贝/106 个细胞。
结论：
ddPCR比荧光定量具有更高的敏感度，可以实现痕量检测。
借鉴意义：
对追踪到的密切接触者并接受医学观察的疑似人员进行早期筛查时，可考虑使用ddPCR进行核酸检测，早发现早隔离、早治疗防扩散。
参考文献4：
Whale, A. S., Devonshire, A. S., Karlin-Neumann, G., Regan, J., Javier, L., Cowen, S., Huggett, J. F. (2017). International Interlaboratory Digital PCR Study Demonstrating High Reproducibility for the Measurement of a Rare Sequence Variant. Anal Chem, 89(3), 1724-1733. doi: 10.1021/acs.analchem.6b03980
内容简述：
在没有标准参考物质及无需校准的情况下，北美和欧洲的21个实验室利用ddPCR针对以KRAS G12D点突变作为检测靶标，盲测4个不同样本（最低突变丰度0.17%），其数据结果具有高度的重复性。同时，由于有些荧光定量 PCR仪需要校准且样品中存在竞争性野生型序列，使用荧光定量PCR来重现性地量化该靶标比较困难。而ddPCR表现出更好的重复性和一致性。
结论：
ddPCR可弥补荧光定量PCR在重复性上的不足。
借鉴意义：
同一样本在不同的荧光定量PCR仪、不同试剂盒、不同实验室检测的结果也可能出现有差异的情况。通过使用ddPCR, 有助于排查原因，提高疑似患者核酸检测结果的可靠性及可重复性，可作为复检的手段。
参考文献5：
Tanis C. Dingle.,Ruth Hall Sedlak., Linda Cook., and Keith R. Jerome.(2013). Tolerance of droplet-digital PCR versus real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013 Nov; 59(11): 1670–1672. doi: 10.1373/clinchem.2013.211045
内容简述：
ddPCR由于将反应体系进行微滴分隔处理，对干扰物质如临床相关的SDS，EDTA和肝素等表现出更高的耐受性。
结论：
使用RASC在大多数未经治疗的TB患者呼出的生物气雾剂中鉴定出Mtb。ddPCR检测比固体培养基上的分枝杆菌培养法更为灵敏。
借鉴意义：
不同区、县采样后送检的血液等样品，提取核酸后可能存在对PCR扩增的抑制因子如肝素等。这些PCR抑制剂的存在，对qPCR检测结果会有一定干扰，而使用ddPCR, 与qPCR相比具有更强的耐抑制性能。
在新型冠状病毒疫情防控中，Bio-Rad将与奋战在抗击病毒一线的英雄们在一起。我们将春节不休，照常服务，提供技术支持和物料保障。此外，Bio-Rad实时定量PCR扩增仪（注册证编号：国械注进20193220316）及QX200型数字PCR仪已做好国内库存准备，随时待命响应各级防控机构工作需要。
2019年12月底在武汉发现的新型冠状病毒肺炎已传播至国内13个省（区、市），截止2020年1月22日，累计报告新型冠状病毒感染的肺炎确诊病例549例，疑似137例，报告死亡病例累计17例。国外也陆续出现确诊病例的报道。
世界卫生组织已正式将造成此次疫情的新型冠状病毒命名为2019 新型冠状病毒( 2019-nCoV )，并发布了针对疑似新型冠状病毒感染造成严重急性呼吸道感染的临床管理临时指导意见。2019-nCoV是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。目前新型冠状病毒传染源尚未找到。
Bio-Rad微滴式数字PCR技术（ddPCR）是第三代PCR技术，无需标准参照物质即可给出样本的拷贝数浓度而非Ct值，其检测结果为判读提供量化的依据。根据LOB(limit of blank)和未知样本的定量结果作出判读，可避免人为错误，缩小灰区，提高检出率。
ddPCR独有的微滴处理技术，使其对PCR扩增效率的变化不再敏感，不惧含有PCR抑制物样本的挑战。随着疫情的变化以及流行病学调研的推进，更多类型的检测乃至环境监测也可能需要进行，ddPCR的这一优势会发挥作用。此外，如果新型冠状病毒发生变异，病毒基因序列上引物、探针靶向位置出现SNV，ddPCR亦能克服引物、探针结合能力下降带来的扩增效率变化，确保稳定检出。不仅如此，还能根据样本微滴荧光信号的变化，发现引物探针靶标区域可能出现变异的病例，为NGS测序分析病毒变异提供样本，助力流行病学研究。
应用如下
2019- nCoV病毒检测方法
疑似病人的快速取样和检测是防止疫情扩散的当务之急。目前新型冠状病毒的诊断，是在符合疑似病例标准的基础上，对痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等样本进行荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框1ab（open reading frame, ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针序列：
Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'
在荧光定量PCR上的结果判断：
阴性:无Ct值或Ct为40；
阳性：Ct值<37，可报告为阳性；
可疑：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。
数字PCR实验，建议采用官方机构推荐的引物、探针序列，结合Bio-Rad ddPCR RNA一步法预混液，经优化反应条件后使用。实验步骤如下图：
部分参考文献
参考文献1：
D Zhou., Y Li., J Li., J Yu., H Yang et.al; Construction of Lentivirus-Based Reference Material for RT-PCR Detection of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus and Its Application in External Quality Assessment. J Nanosci Nanotechnol. 2019 Sep 1;19(9):5510-5516. doi: 10.1166/jnn.2019.16591.
内容简述：
自2012年首次检测到中东呼吸系统综合症冠状病毒（MERS-CoV）以来，核酸扩增技术（NAT）一直是用于快速检测MERS-CoV的最常用的技术。开发稳定、安全的阳性标准品以评估核酸扩增检测的可靠性，并在不同的实验室中执行外部质量评估（EQA）有重要的意义。在这项研究中，MERS-CoV RNA片段包括upE，ORF1b和N被包装在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）颗粒中。利用ddPCR方法，发现冻干的病毒样颗粒（VLP）核酸在37°C或更低温度下稳定，不仅可以安全地用作PCR检测MERS-CoV的对照材料，而且还可以用作EQA的参考材料。在中国宁波国际旅行医疗中心组织的一次EQA中，有49家参与机构在使用各种商业诊断试剂盒和不同提取方法检测MERS-CoV时，虽然有相对一致的结果，但同一样品在不同实验室报告的Ct值不同，这意味着需要对实验室之间的RNA提取方法和/或PCR检测条件进行标准化。
结论：
QX200可用于阳性标准品的标定，且可获得比qPCR更一致的结果。在实际工作中，可以解决没有阳性对照的情况下的检测结果准确性问题。
借鉴意义：
ddPCR可以不依赖于标准品实现绝对定量，结果可靠，还可以用于不同试剂盒之间的性能比较、验证。
参考文献2：
Patterson B., Morrow C., Singh V., Moosa A., Gqada M.,et.al; Detection of Mycobacterium tuberculosis bacilli in bio-aerosols from untreated TB patients. Version 2. Gates Open Res. 2018. doi: 10.12688/gatesopenres.12758.2.
内容简述：
结核病（TB）主要是空气传播的疾病。但是对包含病原菌结核分枝杆菌（Mtb）的生物气溶胶进行定量和定性分析非常具有挑战性。本文目的是从新诊断的结核病患者中采样生物气溶胶，以检测和计数结核杆菌。方法：在定制的呼吸气雾采样室（RASC）中，在1小时内对35例新诊断出痰阳性的TB患者进行了监测。RASC（1.4m的小型洁净室）结合了空气动力学粒径检测，实时CO 2监测以及咳嗽声音记录。利用微滴式数字PCR（ddPCR）可以检测每个生物气溶胶收集装置中的Mtb。
结论：
使用RASC在大多数未经治疗的TB患者呼出的生物气雾剂中鉴定出Mtb。ddPCR检测比固体培养基上的分枝杆菌培养法更为灵敏。
借鉴意义：
在高铁，车站，飞机等人员密集区进行环境采集样品如空气颗粒、水样的监测，ddPCR有更高的灵敏度。
参考文献3：
Persaud, D., Gay, H., Ziemniak, C., Chen, Y. H., Piatak, M., Jr., Chun, T. W., Luzuriaga, K. (2013). Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant. N Engl J Med, 369(19), 1828-1835. doi: 10.1056/NEJMoa1302976
内容简述：
该文是2013年新英格兰杂志发表的使用Bio-Rad ddPCR对HIV检测的文献，主要是对婴儿在出生后30小时开始接抗逆转录病毒治疗，并持续监测其体内HIV病毒含量的应用，ddPCR的检测灵敏度达到LOD <3 拷贝/106 个细胞。
结论：
ddPCR比荧光定量具有更高的敏感度，可以实现痕量检测。
借鉴意义：
对追踪到的密切接触者并接受医学观察的疑似人员进行早期筛查时，可考虑使用ddPCR进行核酸检测，早发现早隔离、早治疗防扩散。
参考文献4：
Whale, A. S., Devonshire, A. S., Karlin-Neumann, G., Regan, J., Javier, L., Cowen, S., Huggett, J. F. (2017). International Interlaboratory Digital PCR Study Demonstrating High Reproducibility for the Measurement of a Rare Sequence Variant. Anal Chem, 89(3), 1724-1733. doi: 10.1021/acs.analchem.6b03980
内容简述：
在没有标准参考物质及无需校准的情况下，北美和欧洲的21个实验室利用ddPCR针对以KRAS G12D点突变作为检测靶标，盲测4个不同样本（最低突变丰度0.17%），其数据结果具有高度的重复性。同时，由于有些荧光定量 PCR仪需要校准且样品中存在竞争性野生型序列，使用荧光定量PCR来重现性地量化该靶标比较困难。而ddPCR表现出更好的重复性和一致性。
结论：
ddPCR可弥补荧光定量PCR在重复性上的不足。
借鉴意义：
同一样本在不同的荧光定量PCR仪、不同试剂盒、不同实验室检测的结果也可能出现有差异的情况。通过使用ddPCR, 有助于排查原因，提高疑似患者核酸检测结果的可靠性及可重复性，可作为复检的手段。
参考文献5：
Tanis C. Dingle.,Ruth Hall Sedlak., Linda Cook., and Keith R. Jerome.(2013). Tolerance of droplet-digital PCR versus real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clin Chem. 2013 Nov; 59(11): 1670–1672. doi: 10.1373/clinchem.2013.211045
内容简述：
ddPCR由于将反应体系进行微滴分隔处理，对干扰物质如临床相关的SDS，EDTA和肝素等表现出更高的耐受性。
结论：
使用RASC在大多数未经治疗的TB患者呼出的生物气雾剂中鉴定出Mtb。ddPCR检测比固体培养基上的分枝杆菌培养法更为灵敏。
借鉴意义：
不同区、县采样后送检的血液等样品，提取核酸后可能存在对PCR扩增的抑制因子如肝素等。这些PCR抑制剂的存在，对qPCR检测结果会有一定干扰，而使用ddPCR, 与qPCR相比具有更强的耐抑制性能。
在新型冠状病毒疫情防控中，Bio-Rad将与奋战在抗击病毒一线的英雄们在一起。我们将春节不休，照常服务，提供技术支持和物料保障。此外，Bio-Rad实时定量PCR扩增仪（注册证编号：国械注进20193220316）及QX200型数字PCR仪已做好国内库存准备，随时待命响应各级防控机构工作需要。
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