大肠杆菌HMS174（DE3）菌种

特别提示：包括大肠杆菌HMS174（DE3）菌种在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：大肠杆菌HMS174（DE3）菌种
英文名称：E.coli HMS174（DE3）Strain
产品货号：BTN12-112y
产品规格：0.5 mL

HMS174（DE3）是染色体上携带lacUV-T7 RNA聚合酶基因的专门用于蛋白表达的K-12菌株。

产品特点：
1．染色体携带DE3溶源性?原噬菌体，其上带有lacUV-T7 RNA聚合酶基因，可在IPTG诱导下表达T7 RNA聚合酶。跟pET系列载体和其他T7启动子驱动的表达体系兼容。
2．RecA突变使得三种重组途径缺失，外源基因（包括整合进入染色体的DE3?原噬菌体）非常稳定。
3．具有完整的乳糖代谢途径，故在诱导蛋白表达时，可以用乳糖同时作为唯一碳源和诱导剂（乳糖在细胞内被?-半乳糖苷酶降解成葡萄糖和半乳糖后，后者可以诱导lac启动子的表达），因此不需要IPTG作为诱导剂，成本比BL21（DE3）以葡萄糖做碳源，以ITPG做诱导剂的表达模式低，适合工业级大规模表达外源蛋白。
4．菌株具有利福平抗性。

基因型：
大肠杆菌HMS174(DE3)菌种的基因型是：K-12,F-,λDE3[lacI,lacUV5-T7 gene1,ind1,sam7,nin5],recA1,hsdR19,IN(rrnD-rrnE)1,rph-1,rpoB331(rif^R)。

大肠杆菌HMS174(DE3)菌株的基因型符号及其含义列表如下：

基因型	表现型
K-12	K-12系的所有菌种默认都携带F因子和λ、e14、rac三种原噬菌体。其中的e14携带野生型mcrA基因，其产物可对甲基化的CG切割。
F-	此菌种缺失F因子
λDE3[lacI,lacUV5-T7 gene 1,ind1,sam7,nin5]	染色体携带DE3 λ原噬菌体，此片段又携带lacI、sam7I等基因和由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因
hsdR19	EcoK系统的限制性内切酶Eco失活，不酶切没甲基化的Eco位点
IN(rrnD-rrnE)1	rrnD-rrnE区域发生颠倒
recA1	DNA重组活性降低
rph-1	通过移码突变影响其下游的pyrE基因表达，使得嘧啶的合成达不到最佳浓度
rpoB331(rifR)	具有利福平抗性

保存条件：-80℃，有效期一年

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名称：毕赤酵母GS115菌种
货号：BTN12-154y
规格：1 mL
GS115是毕赤酵母菌株，属于真核细胞。一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的，因此为了防止大肠杆菌等原核生物对酵母培养菌株污染，往往会在培养基中加入一些氨苄和卡那霉素的抗生素，来抑制细菌的污染和生长。GS115毕赤酵母自身表型为Mut+，但是GS115转化株既能够产生出Mut+菌株，也能够产生出Muts菌株。目的蛋白在这两种转化株的表达水平可能是不同的，并且具有不可预测性，所以只有通过实验才能得到最好的酵母表达方案。

毕赤酵母适宜的生长温度是28至30℃，温度超过32度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。GS115毕赤酵母是是组氨酸缺陷型（His4基因型），如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10⁸。GS115毕赤酵母可以在YPD培养基(BTN130895)中生长，或者在补充有组氨酸的minimal media中生长，但是无法在单独的minimal media培养基中生长。

本菌株的基因型为His4，表型是Mut+。

使用方法：
质粒转化毕赤酵母GS115的菌株的方法有很多，如电转化、化学转化等。根据实验方法的不同，用的试剂和培养基有所不同。本手册提供一个电转化方法。

1．挑取酵母单菌落，接种至含有5mLYPD培养基的50 mL三角瓶中，30℃，250-300 r/min培养过夜；
2．取100-500 μL（≤1:100）的培养物接种至含有50 mL新鲜培养基的200 mL三角摇瓶中，28~30℃，250-300 r/min培养过夜(约20小时)，至OD600达到1.3~1.5；
3．将细胞培养物于4℃，1500g离心5分钟，用50 mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
4．按步骤3离心，用25 mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
5．按步骤3离心，用2-5 mL，1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
6．按步骤3离心，用160 μL的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240μL；
7．将5~20 μg的线性化DNA溶解在5~10 μL TE溶液中，与80 μL的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；
8．将电转化杯冰浴5分钟；
9．根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击（推荐：电压1.5 kV；电容25 μF；电阻200 Ω；电击时间为4～10 msec）。
10．电击完毕后，马上加入1 mL 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5 mL的EP管中，置于30℃摇床低速培养1小时；
11．将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 μL涂布一块平板；
12．将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。

保存条件：-80℃

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