琼脂糖凝胶6FF

特别提示：包括琼脂糖凝胶6FF在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：琼脂糖凝胶6FF
英文名称：Sepharose 6FF
产品货号：Y13344
产品规格：100ml

储存条件：2～8℃
外观：含20%乙醇，底部为乳白色胶体

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名称：GST标签纯化树脂
货号：QN4045
规格：5ml|10ml
pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。GSTs是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生。谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。

别名：谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B
粒度：45-165µm
流速：75cm/h          
工作pH：4～10
耐压：0.3Mpa
载量：＞5mg谷胱甘肽S-转移酶
储存条件：4℃保存，有效期至少一年。

使用说明：
谷胱甘肽树脂的处理：
1．轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2．取部分匀浆放入15mL聚丙烯管（每100mL细菌培养物大约需要2mL匀浆）。
3．4℃ 500g离心5分钟，小心去掉上清。
4．在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS，颠倒数次混匀，4℃ 500g离心5分钟，小心去掉上清。
5．每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。制备细胞抽提物：
6．每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS缓冲液中。
7．加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。
8．用针筒将10mL浓度为0.2%的TritonX-100强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。加入DNase和RNase至终浓度5μg/mL,4℃振动温育10分钟，4℃ 3000 g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L。纯化融合蛋白：
9．细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100毫升细菌培养物加2mL树脂，于室温轻摇30min。
10．混合物于4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚凝胶电泳。
11．沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。
12．4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚凝胶电泳。
13．重复步骤11和12两次。
14．结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：
15．沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白。
16．4℃以500g离心5分钟，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。
17．重复步骤a和b两次，合并3次上清。蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：
18．在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa因子（根据融合蛋白中的位点选择），每mL树脂加入50单位溶于1mLPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2—16小时。用小规模实验确定精确时间。
19．4℃以500g离心5分钟，上清小心移至新管中。（GST仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分离）
20．10% SDS聚凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。试剂配制：谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

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