Western Blotting DAB显色法检测试剂盒

特别提示：包括Western Blotting DAB显色法检测试剂盒(黄色)(兔IgG)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Western Blotting DAB显色法检测试剂盒(黄色)(兔IgG)
英文名称：DAB chromogenic reagent kit For Western Blotting
产品货号：ZN1933
产品规格：1盒

工作原理：聚合标记法是一种酶标记方法，其敏感性比普通酶标法有明显提高。用于 Western Blotting的免疫学检测，更能体现其优点。不仅能大量地节约一抗，更重要的是使条带更清晰，甚至能检测出普通酶标法无法检测出的微量条带。DAB 是过氧化物酶最重要的显色剂之一，反应产物为不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物，适合于免疫印迹的显色反应。本产品采用特殊配方，具有操作简单，储存稳定，信号灵敏度高，持续时间长，背景低，结果易保存等优点。
保存条件：－20℃冷冻保存。DAB 显色试剂应避光保存。
有效期：一年。
试剂盒的内容：
(1)封闭试剂：10 g 蛋白干粉×2 包。
(2)浓缩抗体稀释液：20 ml×1 瓶，为10倍浓缩液。
(3)聚合过氧化物酶标记山羊抗兔IgG0.2ml，效价 1：200-400。亲和纯化抗体，经聚合法标记过氧化物酶。
(4)DAB 显色试剂，含：
显色剂 A：DAB×40倍浓缩液，3ml。
显色剂 B：H2O2×40倍浓缩液，3ml。
显色剂 C：×40倍 TBS 浓缩缓冲液，3ml。
使用说明 需要而未提供的试剂和器材：
1．转印了蛋白样品的NC 膜或PVDF 膜：通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质抗原，将 PAG 胶上的蛋白质转印到硝酸纤维素膜(NC 膜)或PVDF 膜上。
2．稀释缓冲液：使用中性稀释缓冲液即 0.02 M PBS或0.02M TBS(AR0144)配制封闭液和抗体稀释液。0.02 M PBS(pH7.2-7.6)：1000 ml 蒸馏水加 Na2HPO4 2.8 g ，NaH2PO4 0.4 g，NaCl 8.5 g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。0.02M TBS(pH7.2-7.6)：1000ml 蒸馏水中加 Tris 2.42g,NaCl 9g; 纯乙酸或浓盐酸调节 pH 值(7.2-7.6)。
3．洗涤缓冲液：每 1000ml 中性稀释缓冲液中加入 0.5 ml Tween20 即可。
4．一抗：选择适合的一抗，用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体工作浓度为1μg/ml,具体的稀释度取决于特异性的一抗和膜上的抗原的量。
5．摇床：膜的封闭、抗体孵育和洗涤都需平稳摇晃，需在摇床上操作。
6．相机：记录结果。
操作程序：
1．通过聚凝胶电泳分离蛋白样本和分子量标准。
2．将蛋白样本转移至硝酸纤维素膜或PVDF 膜上。
3．封闭硝酸纤维膜：用封闭蛋白干粉 2 g,加稀释缓冲液 100 ml，20-37℃封闭 1-2 小时。用量以浸没整张膜为准。
4．用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 5分钟,1次。
5．配制抗体稀释液：取 90 ml 稀释缓冲液加 1 g 封闭蛋白干粉和 10 ml浓缩抗体稀释液即可。一抗、二抗均用此稀释液稀释。
6．硝酸纤维膜孵育一抗：用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体浓度 1μg/ml,20-37℃孵育2 小时左右。如果缺乏特异性的条带或阳性不强，应提高一抗的浓度；如果有非特异性的条带，应提高一抗的稀释度。
7．用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维素膜 3次,每次 5分钟。
8．硝酸纤维膜孵育二抗：用抗体稀释液稀释相应的酶标二抗，效价 1：200-400。37℃孵育一个半小时左右。用户可根据实际染色*况对稀释度做适当调整。
9．用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维膜 4次,每次 5分钟。
10．DAB 显色:使用 DAB 显色试剂。按每 2 ml 蒸馏水加显色剂 A，B，C 各１滴，混匀。混匀后加至膜上。室温显色。一般显色 1－30分钟。
若无背景出现则可继续显色。显色后用蒸馏水洗涤以终止反应。
11．观察，照相。
注意事项：
1．试剂频繁使用时置４℃，不常使用时置－20℃。显色剂 A 需置－20℃冷冻保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用。
2．显色工作液应新鲜配制。

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货号	名称	规格
YT102	Alexa Fluor 350抗兔免疫荧光染色试剂盒	>300次
YT112	Alexa Fluor 488抗小鼠免疫荧光染色试剂盒	>300次
ZN1887	阳性对照蛋白(组织细胞)样本	100μl
ZN1957	BSA	5g
ZN1849	免疫荧光试剂盒(山羊源一抗)(DyLight488)	2ml|4ml|10ml
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名称：Western洗涤液(10X)
货号：YT069
规格：100ml|10×100ml
本品可以用于Western时一抗或二抗孵育后的洗涤。适当的洗涤可以降低背景，增强信噪比。按照每张膜洗涤需要5-10毫升Western洗涤液(1X)计算，一个包装的Western洗涤液可以洗涤1000-2000次。

注意事项：本Western洗涤液(10X)配制成Western洗涤液(1X)后，宜4℃保存，并在1-2个月内用完。如果室温保存，宜在1-2周内用完。

储存条件：4℃，有效期一年。

名称：Western二抗稀释液
货号：YT070
规格：100ml
本品可以用于Western时二抗的稀释。经本Western二抗稀释液稀释的二抗可以在1-2周内重复使用3-5次。按照每个二抗稀释10毫升计算，一个包装的Western二抗稀释液可以稀释10个或10次二抗。

注意事项：本Western二抗稀释液经过滤除菌处理，使用过程中应尽量避免细菌污染。一旦启用后建议在一个月内用完，如果发现有沉淀或细菌污染请弃用。

储存条件：4℃，有效期一年。

名称：免疫染色洗涤液(10X)
货号：YT885
规格：100ml|10×100ml
本品可用于免疫荧光(Immunofluorescence, IF)、免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry, IC)等免疫染色时固定、一抗或二抗孵育后的洗涤。适当洗涤可以降低背景，增强信噪比。

本免疫染色洗涤液中含有适量Triton X-100，可以通透细胞膜。经本免疫染色洗涤液处理的细胞或组织样品，可以检测细胞内的目的蛋白，包括细胞浆内和细胞核内的目的蛋白。

按照每个样品洗涤需要0.1-1毫升免疫染色洗涤液(1X)计算，一个包装的本产品可以洗涤1000-10000个样品。

注意事项：本免疫染色洗涤液(10X)配制成免疫染色洗涤液(1X)后，宜4℃保存，并在1-2个月内用完。如果室温保存，宜在1-2周内用完。

储存条件：4℃，有效期一年。

名称：EDTA抗原修复液(50×)
货号：SY0764
规格：100ml
免疫染色实验，细胞或组织往往需要经、甲醛或其他醛类固定来维持本身的形态结构，然而此步操作通常会封闭抗原决定簇，使得相当多的抗原不能与抗体很好的进行反应，从而引起染色信号衰减，甚至出现假阴性现象。引起抗原决定簇被掩盖的原因在于：1）醛类固定剂导致组织上的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键，从而封闭抗原表位；2）醛类固定剂在固定过程中与蛋白质发生交联（cross-link），形成醛交联蛋白，导致抗原表位被封闭。因此，需要对固定组织进行抗原修复（antigen retrieval，AR）来逆转被掩盖的抗原表位，使其重新暴露出来，恢复抗原表位-抗体的结合能力，从而改善染色效果。

抗原修复的方法非常多，主要有热诱导的抗原修复（Heat Induced Epitope Retrieval，HIER）和酶诱导的抗原修复（Proteolytic Induced Epitope Retrieval），修复方法的选择需要考虑到抗原表达程度、抗体要求、组织类型以及组织固定方法等因素。作为免疫染色至关重要的一步，抗原修复方法的选择、温度、pH值、修复时间、修复介质都会影响到实验结果。实验者需根据自身的实验体系以及实验条件来选择恰当的修复溶液，从而达到最佳的修复效果。

本品为EDTA抗原修复缓冲液，pH8.0，是一款非常经典且应用广泛的热修复缓冲液之一，适用于大多数的抗原，经此缓冲液修复后的染色信号明显得以增强。本品特别适合用于石蜡切片，也可用于冰冻切片等其他样本。本品为50×浓缩的EDTA抗原修复液，使用前需用ddH2O稀释成1×工作液。按照每个片子需10ml抗原修复液的量来计算，约可做500个样品。

注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）抗原修复通常用于醛类固定的石蜡切片，而冰冻切片由于组织比较脆弱，易在修复过程中被破坏掉，因此比较少进行抗原修复。然而醛类固定的冰冻切片同样会发生蛋白交联而封闭抗原表位，导致染色效果不佳。很多文献资料表明采用适当的方法进行冰冻切片抗原修复，也能显著改善染色效果。特别是当染色效果欠佳的前提下，可考虑进行冰冻切片的抗原修复。
3）修复过程中一定要使用足量的修复液（1×）来完全浸没组织切片。
4）不同pH的修复液对修复效果的影响很明显，归于传统习惯使用柠檬酸钠修复液，pH6.0（SY0763）比较多。目前很多资料表明绝大多数抗原（抗体），使用高pH值（约8.0或9.0）的修复液能得到更好的染色效果。

储存条件：-20℃，有效期一年。

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