酿酒酵母EBY100菌种

特别提示：包括酿酒酵母EBY100菌种在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：酿酒酵母EBY100菌种
英文名称：Saccharomyces cerevisiae EBY100 Strain
产品货号：BTN12-198y
产品规格：1 mL

EBY100是酿酒酵母菌株，属于真核细胞，具有氨苄和卡那霉素抗性。质粒转化条件为电转化，应用于酵母表面展示。此菌株必须生长在营养丰富的培养基中，例如YPD培养基，无法在minimal media中生长。在GAL1启动子的作用下，此菌株能够表达AGA1基因。EBY100的配套载体是pYD1载体。

酿酒酵母EBY100菌种的基因型：
MATα ura3-52 trp1 leu2?1 his3?200 pep4::HIS3 prb1?1.6R can1 GAL(pIU211:URA3)。

使用方法：
本手册提供一个质粒转化酵母的电转化方法，供参考。

自备试剂：YPD培养基（货号：BTN130895）、TE缓冲液（pH 7.5）、乙酸锂、DTT、山梨醇、超纯水等

一、感受态细胞制备
1．挑一环酵母菌接种于5mLYPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；
2．取适量的过夜培养液分别接种于两瓶50 mL YPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18小时（OD：1.3-1.5）；
3．于4℃，4000g离心收集菌体，用25 mL冰浴的无菌水洗涤一次后，细胞用10 mL冰浴的无菌水重悬，可换成较小的离心管；
4．加入1 mL的10×TE缓冲液（pH 7.5），摇晃均匀，再加入1 mL 10×乙酸锂，旋转摇匀，于30℃轻轻摇动45分钟；
5．再加入0.4 mL 1mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30℃轻轻摇动15分钟；
6．于4℃，4000-6000 g离心，弃上清（用枪吸），再用25 mL冰浴的无菌水洗涤后4℃离心，收集菌体；
7．用2.5 mL冰冷的1mol/L山梨醇重悬细胞，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；
8．每管用100μL1mol/L的山梨醇溶解，分装于EP管中（80μL/管），于-70℃冰箱保存。

二、电转化
1．向感受态细胞中加入约5～10μg（体积小于10μL）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5分钟；
2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5 KV，25 uF，200欧姆（详细请参考电穿孔仪的说明书）；
3．立即加入1 mL预冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀，转移至EP管中，于30℃静置1小时；
4．离心，弃上清，加入1 mL YPD后，于30℃、200 rpm培养2小时；
5．离心得菌体后，吸除550μL上清液，然后按150μL/板在相应的选择培养基平板，于30℃培养3-6天，直到平板上出现菌落。
注：酿酒酵母适宜的生长温度是30℃，温度超过32℃可能导致细胞的死亡。

保存条件：-80℃，有效期一年。

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