酵母双杂交文库

自1989年Field等人建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白相互作用的系统以来，酵母双杂交系统已经越来越多的应用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、鉴定蛋白级联底物以及鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响等。有文献统计，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的！

但是很多科研工作者都为酵母双杂文库中假阳性比较高的问题而烦恼着。欧易生物结合多年构建文库的经验，在现有酵母双杂交文库构建流程（CLONTECH专利的BD Matchmaker^TM library）基础上加入独特步骤，使文库中高丰度表达基因明显降低，从而使筛选时假阳性率明显降低，为您的科研提供更多的便利！

酵母双杂交文库技术指标：

1、库容量≥10⁶；

2、文库滴度≥10⁷cfu/ml；

3、插入片段平均大于1kb（该数据以人类样本构建酵母双杂文库的结果为参照，如样品物种不同，且无参考数据，则我们不作出承诺）；

4、减低高丰度表达基因10-100倍。

技术服务内容：

A、均一化酵母双杂cDNA文库

总RNA提取、纯化→LD PCR 合成cDNA→cDNA均一化→均一化cDNA产物与线性化的AD质粒共转化于酵母感受态（真核生物同源重组修复）→所有转化液涂于40-100块15cm平板→计数文库→效价→集合所有克隆得到最终文库。

B、普通酵母双杂cDNA文库

总RNA提取、纯化→LD PCR 合成cDNA→cDNA产物与线性化的AD质粒共转化于酵母感受态（真核生物同源重组修复）→所有转化液涂于40-100块15cm平板→计数文库效价→集合所有克隆得到最终文库。

材料要求：

为客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA。

服务完成时提供：

A、详细实验报告

B、该酵母文库甘油冻存管

服务周期：获得合格的总RNA后，45个工作日

目前我们已经分别为中国科学院上海植物生理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院等多家单位完成酵母双杂交文库构建服务，物种包括人、小鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱等。欢迎随时与我们联系！

附：酵母双杂交原理

酵母双杂交系统是目前研究蛋白-蛋白相互作用的主流方式之一，这种体外互作实验是在酵母这种真核细胞生物中进行的，很大程度上模拟了研究材料的体内环境。简而言之，该策略就是将编码诱饵蛋白（Bait）和靶蛋白（Target）的基因分别融合构建于带有酵母内源转录因子基因（例如GAL4）的DNA Binding Domain序列和Activation Domain序列的两个载体上（图A）；由于GAL4调控目标启动子启动转录需要上述两个结构域空间上相互接近，即只有当诱饵蛋白与靶蛋白存在相互作用才能使得GAL4蛋白结构完整并启动报告基因的表达（图B）。

    报告基因一般选择某营养物质的合成基因来弥补营养缺陷型酵母宿主菌的缺陷，或者是LacZ这样的可用于组化显色的基因。

特点与优点：

    酵母双杂交系统的最主要应用是快速且直接分析已知蛋白之间的相互作用以及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码它的基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：

1、相互作用的信号是在融合基因表达后，在酵母细胞内重建完整的转录因子结构的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤；

2、检测在真核活细胞内进行，可以在一定程度上代表研究材料细胞内真实情况；

3、检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用；

4、酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。本公司采用CLONTECH专利的BD Matchmaker^TM library, 其LD-PCR策略使得所需材料的总RNA的起始浓度大大减少（1-2mg）；

5、可以用来比对病变组织，更快的找到突变基因或者导致变异的蛋白，更快的找到攻克方向；

6、利用研究的已知蛋白基因为诱饵，在已经构建好的某组织材料特异表达的cDNA酵母AD文库中钓取可能的互作蛋白；

7、采用Yeast mating策略，实现酵母AD文库使用的反复性，在大规模高效筛选的同时缩减了研究成本。