GENMED细胞多聚ADP核糖聚合酶-1活性比色法

GENMED细胞多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

GENMED细胞多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚，受到PARP-1的作用，释放出显色产物对硝基苯酚，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体等）多聚ADP核糖聚合酶-1的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

 

技术背景

 

多聚ADP核糖聚合酶-1（Poly (ADP-ribose) Polymerase；PARP；EC 2.4.2.30）是一种锌依赖性核酶，广泛存在于真核细胞中。PARP家属由18个成员，其中6个已经被证实，包括PARP-1（占90％）、PARP-2、PARP-3、PARP-4（VPARP）、PARP-5a/5b（tankyrase）等。PARP蛋白由4个结构域构成：DNA结合、切离、自修饰（automodification）、催化等结构域。其功能在于特异性地识别DNA损伤产生的单链或双链DNA断裂，并与之结合而激活，催化将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）转化成烟酰胺（nicotinamide）和多聚ADP核糖分枝聚合体（branched polymers of various poly (ADP-ribose)）的反应，由此引导各种DNA修复蛋白聚集到损伤部位，实施修复，同时调节染色质结构形成（chromatin structure formation）、 细胞分化、繁殖、发育、凋亡、基因表达等，以及对于心脑缺血的反应和肿瘤恶变的作用。抑制PARP活性，可以防止心衰、中风、败血症等引起的组织损害。其中PARP-1由1014氨基酸残基组成，分子量113Kd，是细胞ATP/NAD细胞凋亡系统的主要调节因子。基于人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚（ADP-ribose-p-nitrophenol），在损伤的DNA存在的前提下，受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用，释放出显色产物对硝基苯酚（p-nitrophenol），通过分光光度仪检测吸光读数的变化（405nm 波长），来定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。其反应系统为：

 

 

产品内容

 

GENMED清理液（Reagent A） 毫升

GENMED裂解液（Reagent B） 毫升

GENMED缓冲液（Reagent C） 毫升

GENMED反应液（Reagent D） 微升

GENMED底物液（Reagent E）   微升

GENMED阴性液（Reagent F）   微升

产品说明书    1份

 

 

 

保存方式

 

保存GENMED裂解液（Reagent B）、GENMED反应液（Reagent D）和GENMED底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；GENMED底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品制备

比色皿或酶标板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

 

实验步骤

 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的GENMED裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

• 样品准备（总蛋白制备）

 

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升GENMED裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

• 测定准备

 

• 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长405nm，并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；GENMED底物液（Reagent E）避免光照；GENMED缓冲液（Reagent C）室温下预热

• 背景对照测定

 

• 移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升GENMED反应液（Reagent D）
• 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
• 加入xx微升GENMED阴性液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育2小时
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数

 

• 样品测定

 

• 移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升GENMED反应液（Reagent D）
• 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
• 加入5微升待测样品（（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白））（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育2小时
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

 

五、计算样品活性

 

 

• 酶标板测定

 

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到96孔板中
• 分别加入xx微升GENMED反应液（Reagent D）
• 分别加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
• 分别加入xx微升GENMED阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动酶标板
• 在25℃温度下孵育2小时
• 即刻放进酶标仪检测：获得背景读数和样品读数
• 活性计算：

 

 

注意事项

 

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 用户可以选择使用核蛋白替代产品中的总蛋白制备
• 测定值由低到高变化；反应可持续2小时
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 样本测定2小时读数高于背景读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度：核蛋白为20微克/5微升；总蛋白为100微克/5微升（本公司提供 GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 多聚ADP核糖聚合酶-1单位活性定义为：在25℃，pH 8.0条件下，每小时内能够释放1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

 

质量标准

 

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感

 

 

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