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用ImageXpress Pico自动细胞成像系统进行细胞表型的多参数评估
点击次数:2791 发布日期:2018-3-13  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

简介
自动细胞成像是一种分析化合物对包括细胞形态,活力和标志物表达在内的细胞表型的影响的有效方法。这里,我们将展示ImageXpress® Pico自动细胞成像系统和CellReporterXpress 自动成像分析软件如何应用于化合物影响的表型分析。成像和分析方法可提供工具来鉴定细胞活力,细胞形态,细胞黏附和伸展,细胞骨架完整性和线粒体膜电位等多种参数。

材料
• HeLa细胞 (ATCC P/N: CCL-2)
• HeLa 培养基
• DMEM: CellGro, with L-谷氨酰胺
(Corning)
• 10% FBS (BenchMark™; Gemini
P/N 100-106)
• 1% penicillin/streptomycin
• Staurosporine (Sigma P/N S5921)
• Mitomycin C (Sigma P/N M4287)
• Paclitaxel (Sigma P/N T7402)
• Etoposide (Sigma P/N E1383)
• Doxorubicin (Sigma P/N D1515)
• Calcein AM
• EarlyTox Live Cell Assay Kit (Explorer Kit,
Molecular Devices P/N R8342)
• Hoechst 33342 (Thermo Fisher, Carlsbad,
CA P/N H3570)
• MitoTracker Orange cMTMRos (Thermo
Fisher, Carlsbad, CA, M7510

•AF488-连接的鬼笔环肽
(ThermoFisher Scientific, Carlsbad,
CA PN A12379)
•384- 孔黑色, 透明底微孔板 (Corning
Falcon P / N 62406-490)
•ImageXpress Pico 自动细胞成像系
统和 CellReporterXpress 自动成像
分析软件

图 1:多参数分析细胞活力和形态学的图像和分析图例。用多种药物处理 HeLa 细胞 72 小时然后,使用核染料 (Hoechst 33342) ,Actin 细胞骨架染料 ( AlexaFluor 488 (AF488) 标记的鬼笔环肽 ) 还有线粒体染料 (MitoTracker Orange CMTMRos) 染色。代表性的图像和分析图例展示了对照细胞和 0.1 μM staurosporine 处理后的细胞的对比。细胞使用 ImageXpress Pico 系统的 DAPI, FITC 和 TRITC 通和 10x PlanFluor 物镜拍摄。图像 ( 上 ) 标记了细胞核 ( 蓝色 ),actin 细胞骨架 ( 绿色 ),还有线粒体 ( 桔色 )。图像使用 CellReporterXpress 软件中为了定量鬼笔环肽阳性细胞 ( 中 ) 和 MitoTracker Orange 阳性细胞 ( 下 ) 而优化的 Cell Scoring 分析模块进行分析。分析结果图例如图所示 ( 浅绿= actin-阳性的核,深绿 = actin细胞骨架,蓝色 = 线粒体-阳性核,红色 = 线粒体-阴性核,桔色 = 完整线粒体。

细胞可实时分别使用 DAPI,FITC 还有TRITC 通道对 Hoechst, Calcein AM 还有 MitoTracker Orange 染色进行成像。用 10x 物镜来拍摄每孔中一个视野的图像为单独一张图像。曝光时间设为DAPI 通道 20 ms,FITC 通道 10 ms,TRITC 通道 200 ms。细胞也可以固定后以后成像或进一步染色额外细胞标志物。注意:Calcein AM 用来评估活细胞且固定以后检测不到 ( 数据未展示 )。MitoTracker Orange 和 Hoechst 33342染色固定后是稳定的。为鉴定 actin 细胞骨架完整性,进而将细胞固定。Mitotracker Orange 和 Hoechst33342 染色后,使用 4% 甲醛溶液固定细胞然后用 PBS 洗两遍。而后用DPBS + 0.01% saponin + 1% FBS 对细胞膜进行穿孔处理 10 分钟。AlexaFluor® 488(AF488) 连接的鬼笔环肽染料用来评估细胞骨架完整性。鬼笔环肽用穿孔缓冲液 (1:50) 稀释并与细胞一起在 37 度孵育 2 小时。细胞用 PBS 洗涤然后使用 CellReporterXpress 软件中为定量 AF488 染色的细胞骨架优化的 Cell Scoring 分析模块进行成像分析。使用 ImageXpress Pico 系统成像活细胞或固定细胞,并用 CellReporterXpress软件进行分析。细胞图像使用两个 CellScoring 程序进行分析:一个以 FITC 作为标记来定量 Calcein AM 或鬼笔环肽阳性细胞数,第二个程序以 TRITC 为标记分析线粒体染色阳性细胞。两套程序都以核染色进行细胞计数和核特征鉴定。

使用自动成像分析定量分析表型影响

一个典型的自动化细胞实验流程包括在微孔板中铺细胞,化合物处理细胞,和自动化成像。对于多色,多参数实验,Calcein AM 可用于鉴定活细胞数或完好的细胞数,描述细胞伸展和鉴定细胞形态学。核染料用于细胞计数,确定增殖和测量核亮度和形状。

来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
联系电话:400 820 3586
E-mail:info.china@moldev.com

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