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利用自动细胞成像系统分析细胞凋亡
点击次数:3357 发布日期:2018-3-13  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

简介
细胞凋亡是一种发生在多细胞生物体内的程序性细胞死亡过程!生化反应导致细胞形态和特征变化及细胞死亡。形态变化包括细胞收缩、核分裂、染色质凝缩、染色 DNA 分裂及 mRNA 衰减。细胞凋亡是一种高度调控的过程,通过内在途经对各种压力源做出响应,包括饥饿、感染、缺氧和氧化应激反应等。线粒体损伤在细胞凋亡的启动过程中发挥重要的作用。在外部通路中,外部信号介导了细胞凋亡的产生,包括肿瘤坏死因子受体家族介导信号。以上两种途径以及细胞死亡进行过程都通过激活 caspase 激酶来实现。细胞凋亡调控过程的破坏与包括癌症在内的许多疾病相关。在这篇应用中,我们介绍一种利用自动细胞成像系统进行细胞凋亡检测的方法。

实验材料
HeLa 细胞 (ATCC P/N CCL-2)
HeLa 培养基
DMEM: CellGro, with L-glutmaine
(Corning)
10% FBS (BenchMark™; Gemini P/N
100-106)
1% penicillin/streptomycin
Staurosporine (Sigma P/N S5921)
Mitomycin C (Sigma P/N M4287)
Camptothecin (Sigma P/N C9911)
EarlyTox Caspase-3/7 NucView488
Assay Kit (Molecular DevicesP/N
R8348)
96-well black( 96孔板 ), clear-bottom
microplates (Greiner P/N 655090)
ImageXpress Pico 自动细胞成像系统
CellReporterXpress 自动成像分析软件

实验方法
将人宫颈癌细胞系 HeLa, 培养在 Greiner 公司黑边底透的 96 孔多孔板中,每孔 5,000个细胞,37°C, 5% CO2 条件下过夜培养。第二天,分别用不同浓度的抗肿瘤化合物十字孢碱 (Staurosporine)、丝裂霉素 CMitomycin C) 和喜树碱 (Camptothecin)处理这些细胞诱导凋亡。化合物的最高浓度分别为:10 μM 十字孢碱;200 μM 丝裂霉素 C;100 μM 喜树碱。加药处理 18 小时后,使用试剂盒 EarlyTox™ Caspase-3/

NucView 488 dye 和 Ethidium HomodimerIII 染料以终浓度 5μM 和 3μM 分别对细胞染色 30 分钟, 之后用 Hoechst 33342以终浓度 6 μM 对细胞进行染色,同时将细胞放回 37°C, 5% CO2 培养箱中静置 15
分钟。

EarlyTox Caspase-3/7 NucView488 试剂盒

Caspase-3、caspase-7 是在细胞程序性死亡过程中被激活的蛋白酶。EarlyTox试剂盒中的 Caspase-3/7 NucView 488底物用来检测完整细胞中 caspase-3/7 活性。底物由一种与 caspase-3/7 DEVD 识
序列结合的荧光 DNA 染料组成。最初没有荧光,底物透过细胞膜进入细胞质中。在凋亡细胞中 caspase-3/7 将底物裂解,释放出的高亲和 DNA 染料与细胞核中的 DNA 结合,在 500 nm 激发光照射下在 530 nm 处发出明亮的绿色荧光,可以用来评价 caspase 激酶的激活水平。Hoechst 33342 核染料用来确定细胞总个数,Ethidium Homodimer 用来确定死细胞 ( 即外膜受损的细胞 ) 的个数。

使用自动细胞成像系统评价细胞凋亡

染色之后,使用 ImageXpress® Pico 自动细胞成像系统,在 10x 物镜条件下对细胞进行成像。每个成像位置分别采集 DAPI,FITC 和 TexasRed 三个荧光通道,曝光时间分别为 20, 500, 和 50 ms。图1 展示了对照细胞及实验组细胞结果,其中实验组的化合物浓度分别为 0.3 μM 十字孢碱、10 μM 丝裂霉素 C。Hoechst 染色为蓝色,凋亡细胞核为绿色,死细胞核为红色。使用 CellReporterXpress 软件中的凋亡分析流程采集样品图像并进行分析,得到凋亡细胞数量和百分含量。同时,通过分析 Ethidium Homodimer 染色结果得到死细胞数量,通过分析 Hoechst 染色结果得到细胞总数的相关参数。根据实验结果生成细胞凋亡、死亡的浓度效应曲线及相应的半最大效应浓度 (EC50) 值见图2。值得注意的是激酶抑制剂十字孢碱 ( 一种已知的细胞凋亡诱导物 ) 的 EC50 值比通过不同的机制介导细胞调亡的丝裂霉素 C低 100 倍左右。

结论
EarlyTox 试剂盒是一种有效的工具,可用于疾病生物学研究、抗肿瘤药物评价及细胞健康状况监测等领域。本篇应用介绍了一种利用 ImageXpressPico 全自动成像系统和 CellReporterXpress 软件对 Early-Tox 试剂盒染色的样品进行凋亡细胞量化和评价的方法和流程。

参考文献
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4. Verweij J1, Pinedo HM. Mitomycin C:mechanism of action, usefulnessandlimitations. Anticancer Drugs. 1990 Oct;1 (1):5-13.

来源:美谷分子仪器(上海)有限公司
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