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雷帕霉素生物活性及实验方法
点击次数:1044 发布日期:2019-1-9  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
雷帕霉素是一种特异性的mTOR抑制剂,IC50为0.1nM
In Vitro:雷帕霉素抑制HEK293细胞内源性mTOR活性,IC50为0.1 nM,比iRap和AP21967更有效,IC50分别为5 nM和10 nM [1]。 雷帕霉素通过诱导自噬发挥其对恶性神经胶质瘤细胞的抗肿瘤作用,并且表明在恶性神经胶质瘤细胞中PI3K / Akt信号传导途径的破坏可以极大地增强mTOR抑制剂的有效性。 雷帕霉素以剂量依赖性方式抑制所有三种细胞系中的细胞活力,但它们的敏感性变化。 T98G,U87-MG和U373-MG细胞的IC50水平分别为2 nM,1μM和>25μM[3]。
 
In Vivo:雷帕霉素(i.p,1.5 mg / kg)治疗几乎完全可以防止7天和14天跖肌重量和纤维大小的肥大增加[4]。 每天用雷帕霉素(2mg / kg体重,腹膜内注射)治疗WT或LS / +小鼠4周,然后每周注射相同剂量另外4周。 雷帕霉素处理的LS / +小鼠心脏的异常胎儿基因表达谱显着逆转[5]。
 
Kinase Assay:将HEK293细胞以每孔2-2.5×10 5个细胞接种于12孔板中,仅在DMEM中血清饥饿24小时。 将细胞模拟处理或用雷帕霉素(0.05-50nM),iRap(0.5-500nM)或AP21967(0.5-500nM)在37℃处理15分钟。 在37℃下将血清加至终浓度为20%,持续30分钟。 裂解细胞,通过SDS-PAGE分离细胞裂解物。 将分离的蛋白质转移至PVDF膜,并用针对p70 S6激酶的Thr389的磷酸特异性一抗进行免疫印迹。 使用ImageQuant和KaleidaGraph [1]分析数据。
 MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。
 
Cell Assay:HL-60,NB4,U937,KG-1和K562细胞常规传代于RPMI-1640中,补充有10%热灭活的FBS,2 mM L-谷氨酰胺,50 U / mL青霉素和50μg/ mL链霉素。 在37°C下,5%CO2加湿的气氛。 对于实验,通过离心收获指数生长的细胞,并重悬于含有10%FBS的新鲜培养基中。 在各种浓度的DMSO或1μMATRA存在下,在BD Falcon六孔板中以2×10 5 / mL的初始细胞密度接种细胞。 在分化剂之前20分钟加入雷帕霉素(20nM)。 在第2天,向每个孔中加入0.3mL新鲜培养基。 通过台盼蓝排除法测定活细胞,并使用血细胞计数器进行定量[2]。
 MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。
 
Animal Administration:大鼠[4]
将雌性Sprague-Dawley大鼠(250-275g),成年雌性SD大鼠(225-250g)随机分配至治疗组或媒介物组,使得每组的平均起始体重相等。药物治疗开始于手术当天或14天停药后重新加载的第一天。雷帕霉素每天一次通过腹膜内注射以1.5mg / kg的剂量递送,溶解在2%羧甲基纤维素中。 CsA每天一次通过皮下注射以15mg / kg的剂量递送,溶于10%甲醇和橄榄油中。 FK506每天一次通过皮下注射以3mg / kg的剂量递送,溶于10%乙醇,10%的cremophor和盐水中。
小鼠[5]
将雷帕霉素以20mg / mL的浓度溶解在乙醇中,过滤灭菌,以1mg / mL的浓度重悬浮于载体(0.25%PEG,0.25%吐温-80)中,并腹膜内注射。 (2mg / kg体重),每天持续4周或每天持续4周,然后每周注射另外4周。注射开始于8周(肥大发作前)或12周(指示确定肥大后),并在治疗4周后或治疗8周后评估小鼠,详见结果和图例。 。作为对照,WT和LS / +小鼠仅用载体处理。
 MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
来源:上海皓元生物医药科技有限公司
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