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单细胞分离和转移的最新用法——单个细胞级别的分离和转移
点击次数:232 发布日期:2018-11-5  来源:http://www.qd-china.com/yingyong2.aspx?id=224
 
 
 
 
 
2014年10月30日发表于Lab on a Chip杂志。
 

 
单细胞分离和转移的最新用法——单个细胞级别的分离和转移
 
   在当代生物学与医学的研究中,对单个细胞的分离一直有着很高的需求。然而传统手段往往需要将大量细胞悬浮后进行分选接种。这类方法不仅费时费力,而且细胞活力也会受到影响。本篇报道中Guillaume使用FluidFM BOT建立了一种非常简易、快速的新手段。
 
单细胞分离有哪些优势?
   由于蛋白和基因的随机表达性,即使同一基因源的细胞也可能会有所不同。因此单细胞分离对于克服细胞异质性有着十分重要的意义。能够让研究者从一群混合细胞群中挑选特定感兴趣的细胞,之后既可以用于单细胞分析,也可以用于单克隆扩增。这种检测手段能够检测到常规细胞检测手段所不能发现的细胞群中的多样性。
   另外对于细胞转染、感染、注射的实验来说,选取单个细胞对于建立特定基因或表达特定蛋白的克隆来说更是十分必要的。因为只有单一基因的细胞群才能最大限度的保持种群稳定。
 
单细胞分离的手段
   在目前的研究中,分离单细胞的手段主要是通过将细胞悬浮后做高通量筛选。其中主要使用的是流式细胞荧光分选技术(FACS)或者免疫磁性细胞分选法(MACS)。这两种方法在临床上目前均广泛应于细胞筛选。然而这两种方法均需要使用相当大量数量的细胞,一般在105-106数量级上。然而很多研究中,培养出的细胞不太容易达到这个数量级。而在少量细胞分选中,这两种方法均面临着极大地挑战。
   微流控芯片技术的出现让少量细胞分选有了新的选择,该方法主要通过荧光、磁力、流体动力流、声光电泳、介电泳粘附等性质进行分离。这种方法往往需要较低的细胞浓度来实现单细胞分离,因此在分离过程中需要严格控制进入微流控芯片中的细胞量。
   上述的分离方法有着广泛的应用,但是其应用却也受到其本身性质的应用。因为无论是哪种方法都仅限于操纵悬浮溶液中的细胞。而对于本身还处在贴壁状态的细胞却需要将其完全解离后才能处理。对于目前的研究,绝大部分的哺乳类细胞任然需要贴壁培养。但是却鲜有成熟的方法能够用于这种分离方式。
 
FluidFM分离方法
   流体力学显微镜(FluidFM)是将微量注射与原子力显微镜技术相结合的最新型显微镜。它能够在细胞表面实现精准的移动和fL级的流体移动控制。因此在技术层面上拥有非常优越的单细胞操纵能力。
   因此Guillaume等首先对FluidFM对单细胞喷洒胰酶的消化能力进行了考察。他们将胰酶喷洒在细胞上方,再观测细胞消化程度随时间的变化。通过他们的研究,他们研究了压力与淋撒体积之间的关系、胰酶作用时间与消化范围之间的关系、胰酶淋撒压力与消化面积之间的关系如图1所示。
图1,胰酶释放控制对细胞消化的影响。A)胰酶释放两样与压力脉冲参数之间的关系;B)胰酶作用时间与消化细胞面积之间的关系(200mbar,10s);C)细胞消化面积与时间之间的关系(200mbar,10s);D)最终消化面积与施加压力的对应关系。
 
   之后他们尝试对单个Hela细胞进行了消化,通过对压力和作用时间的控制,可做到仅将目标细胞分离但不对周围任何细胞产生影响,如图2所示。
图2 单个细胞可控消化 A)将HeLa种在载玻片并对其中一个细胞进行了mRFP-actin转染,在RFP下显示红色荧光。B)在细胞表面喷洒胰酶消化;C)观测到细胞成功消化。
 
   随后他们对含有mRFP-actin的Hela从大量Hela细胞中进行了分离,并取得了成功,如图3A。为了一进步验证这种方法的可靠性,他们再次对这个细胞新型一次消化并转移,细胞仍然存活,如图3B所示。之后他们用这种方法对普通HeLa细胞进行了分离,并且观察了它们的存活状态如图3C-E所示,测定存活率可高达97%。
图3 单细胞分离 A)对含有mRFP-actin的细胞从HeLa细胞群分离;B)对单个mRFP-actin HeLa细胞进行分离;C-E)对分离后的HeLa细胞进行了FDA/PI染色。并种在三种不同的微孔板中。(红色为死亡细胞,绿色为存活细胞)。
 
使用FluidFM分选细胞
   而对于悬浮细胞的分选工作,FluidFM也能够轻松应对。首先Guillaume对单个细胞进行了转移实验。经过实验发现以ΔP = -100 mbar条件对细胞进行吸取,即可将细胞吸入移液枪中。随后将探针转移至新的微孔中再以ΔP = +1000 mbar作用1-2s即可将细胞吐出。在之后的培养中也可观测到细胞贴壁生长,说明这种分选对细胞没有损伤,如图4A所示。
   而后他们对细胞进行了连续分选,将形态相似的细胞放入同一小室,如图4B所示。以及根据荧光标记不同分别放入不同小室,如图4C所示。使用这种方法分选一样简单可靠。
图4细胞分选 A)对活细胞进行分选并记录图像。在分选后1小时,细胞开始贴壁生长;B)连续对细胞进行分选,并放置到同一个小孔中。C)根据染色标记将不同染色的细胞分类放置在不同小室中。
 
总结
   FluidFM是一种强大的分离单细胞的强大手段,通过使用光学手段甄选出感兴趣的细胞后,就能够使用FluidFM技术对其分离,并且不会对细胞造成损伤,能够保证所分离的细胞最大限度的存活。这种方法的应用将会给生物和医学研究提供极大地帮助,尤其对于单克隆细胞群的建立或单细胞的下游分析。
 
多功能单细胞显微操作系统——瑞士 Cytosurge FluidFM BOT
产品简介:
   多功能单细胞显微操作系统--FluidFM BOT,是将原子力系统、微流控系统、细胞培养系统为一体的单细胞操作系统。主要功能包括单细胞注射、单细胞提取以及单细胞分离。
   FluidFM BOT极大的方便了单细胞水平的研究,尤其适合应用于精准医疗、单细胞生物学、单细胞质谱、单细胞基因编辑、药物研发等领域。
 
注射、提取、分选一体化的单细胞操纵解决方案
 
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