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蛋白质检测和定量方法
点击次数:372 发布日期:2018-10-29  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
蛋白质检测和定量方法

蛋白质定量方法最早出现在20世纪50年代早期,当时物理学家和化学家进入生物学领域,并将他们的技术应用于蛋白质的分析和测量。 Lowry蛋白质分析是第一个确定溶液中蛋白质总水平的生化分析。不久之后,该测定通过其他测量方法引入,包括紫外(UV)系统和氨基酸分析。所有这些方法都能够表征水中的蛋白质或非常温和的缓冲溶液。
 
随着蛋白质研究变得更加复杂,定量方法开始发展。 1976年,布拉德福德分析是在天然溶液中研究更多蛋白质并使用清洁剂或其他还原剂来保持蛋白质可溶性的垫脚石。然后将Lowry试验再培养至二辛可宁酸(BCA)测定(也称为Smith测定),这使其更适合用于蛋白质研究的溶剂中。
然而,蛋白质定量的最新创新已存在超过25年。小编将概述当前的蛋白质检测和定量方法,并讨论一种新的基于红外的技术,用于快速准确地测量痕量蛋白质。
 
当前现状
 
用于蛋白质和/或肽测定的一些最常用的方法包括氨基酸分析,紫外(UV)光谱,比色测定,十二烷基硫酸钠  -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和光密度测定,基于免疫学的方法和质谱法。
 
氨基酸分析
 
氨基酸分析测量蛋白质中每种氨基酸的量,并被认为是蛋白质定量的黄金标准方法。该方法可以检测大多数氨基酸,检测范围为1 mg苯基硫代氨基甲酰基(PTC)和5 mg至10 mg茚三酮。该方法不像其他测定那样广泛使用,因为它昂贵,缓慢且需要技术专业知识。因此,氨基酸分析实验室经常被用作核心设施。
 
紫外光谱法
 
紫外光谱法测量样品中芳香族氨基酸的吸光度,是用于蛋白质检测和定量的最常用方法。可以测量任何类型的蛋白质,范围从205nm处的1mg至100mg和280nm处的20mg至1,000mg。紫外分光光度计相对便宜且易于使用。
 
比色分析法
 
通过显色试剂测定蛋白质浓度的比色测定。最常见的比色测定是染料结合和荧光方法。荧光方法包括NanoOrange试剂盒(在570nm处10ng至10mg)和CBQCA(在550nm处10ng至150mg),其通常比染料结合方法更敏感,包括Bradford(1mg至50mg)和Bicinchoninic。 。酸(BCA; 0.2)。镁至50毫克)。
 
大多数蛋白质测定对溶剂条件敏感。有关套件和缓冲组件的更多信息,请访问制造商的网站。该信息使研究人员能够使用蛋白质沉淀或小规模凝胶过滤去除潜在的干扰物质。
 
SDS-PAGE和密度测定法
 
SDS是一种阴离子洗涤剂,可使蛋白质线性化并用负电荷覆盖它们。然后在电泳期间通过大小分离蛋白质,并且可以使用定量光密度测定法测量蛋白质。对于银染色,SDS-PAGE蛋白质测定范围为每条1ng至5ng,对于考马斯蓝,SDS-PAGE蛋白质测定范围为每条40ng至50ng。
 
基于免疫学的方法
 
例如定量酶联免疫吸附测定(ELISA),Western印迹和斑点印迹,是用于蛋白质检测和测量的非常常见且灵敏的测定,其依赖于使用抗体进行蛋白质捕获。这些方法中使用的抗体针对构象和线性表位。对于蛋白质印迹,重要的是使用针对肽或变性蛋白质产生的抗体,因为SDS使抗原变性。
 
质谱法
 
质谱法通常用于功能蛋白质组学,以测量复杂生物系统中蛋白质丰度的微小变化,以响应疾病进展或药物治疗等干扰。然而,质谱法可能昂贵且缓慢,并且需要专业知识来运行仪器。此外,质谱仪可能无法完全量化。
 
新颖的检测方法
 
EMD Millipore提供基于直接检测傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪的新蛋白质/肽定量方法。该系统能够对蛋白质链中的酰胺键进行高精度红外(IR)测量,而不依赖于氨基酸组成,染料结合特性或氧化还原电位。
 
蛋白质在IR光谱中由9个酰胺峰表示,并代表肽键的不同振动模式。特别是,酰胺I和酰胺II键的独特之处在于即使在复杂的混合物,还原剂和洗涤剂存在下它们的信号强度和纯度也是相同的。因此,这些频带用于测量。该系统的准确性与氨基酸分析的准确性相当
 
直接检测系统包括蛋白质检测技术和分析工具,包括预先安装在软件上的BSA标准曲线。该测定仅需要2微升样品,沉积在无测定卡上,置于仪器中然后测量。整个过程大约需要两到三分钟。
 
蛋白质检测和定量是药物开发过程的关键组成部分。有多种方法可供选择,每种方法都有自己的优势和挑战,并且在为每种应用选择最佳方法时需要考虑许多因素。
 
蛋白质定量技术已经使用了半个多世纪,但该领域相对停滞了超过25年。开发新工具对于为研究人员提供快速,易用的蛋白质检测和定量方法至关重要。

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来源:北京百欧博伟生物有限公司
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